毛蚶(Scapharca kagoshimensis)血紅蛋白的類酚氧化酶性質(zhì)及其抗菌活性研究.pdf

1、毛蚶(Scapharca kagoshimensis)隸屬于軟體動(dòng)物門瓣鰓綱,是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋無脊椎動(dòng)物,同時(shí)又是一類較特殊的含有血紅蛋白(hemoglobin,Hb)的雙殼貝類。因其沒有T細(xì)胞,缺乏真正意義上的抗體、沒有類似脊椎動(dòng)物的特異性免疫系統(tǒng),因而只能依靠血細(xì)胞及體液因子的先天免疫反應(yīng)來抵御外界環(huán)境中病原微生物的入侵,其中尤以血細(xì)胞在機(jī)體的防御機(jī)制中發(fā)揮主導(dǎo)作用。Hb是存在于所有脊椎動(dòng)物和部分無脊椎動(dòng)物中的一大類具有

2、可逆載氧能力的含鐵蛋白,最近的研究發(fā)現(xiàn)其除具有運(yùn)輸氧氣的功能外,還具有穩(wěn)定血壓、抗菌、運(yùn)輸硫化物、調(diào)節(jié)酸堿平衡等多種生物學(xué)功能,具有極高的理論研究?jī)r(jià)值。本研究擬利用Sephacryl S-100凝膠過濾柱層析純化技術(shù)和AmiconUltra-4超濾濃縮技術(shù)從毛蚶血細(xì)胞裂解物中分離純化出二聚體和四聚體形式的兩種Hb(HbⅠ,HbⅡ);以L-DOPA為底物證實(shí)其能夠發(fā)揮類酚氧化酶活性(PO-likeactivity),并對(duì)其生化性質(zhì)進(jìn)行鑒定

3、;以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、四聯(lián)微球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、青霉、黑曲霉、面包酵母和裂殖酵母為指示菌,研究毛蚶HbⅡ和HbⅠ的抗菌活性,并以甲醚化海螢熒光素類似物(MCLA)為化學(xué)發(fā)光探針,同時(shí)結(jié)合超氧化物歧化酶(SOD)的特異性抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)毛蚶HbⅡ和HbⅠ的抗菌機(jī)理進(jìn)行研究,旨在揭示毛蚶Hb在非特異性免疫反應(yīng)中的作用并為進(jìn)一步探索其分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　 本文利用Selohacryl S-

4、100凝膠過濾柱層析純化技術(shù)和Amicon Ultra-4超濾濃縮技術(shù)從毛蚶血細(xì)胞裂解物中分離純化出了三種Hb組分,其在SDS-PAGE電泳中顯示為分子量分別為30.28 kDa、28.9 kDa和31.2 kDa的三個(gè)條帶,質(zhì)譜鑒定結(jié)果證實(shí),30.28 kDa.和28.9 kDa組分為HbⅡ的兩個(gè)亞基,31.2 kDa組分為HbⅠ,而凝膠過濾法測(cè)得的HbⅡ分子量為57.8 kDa,與上述結(jié)果相符。酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示,HbⅡ和HbⅠ在非

5、激活的自然狀態(tài)下對(duì)L-DOPA底物均具有類酚氧化酶(phenoloxidase,PO)活性,且其PO活性均可被異丙醇所進(jìn)一步激活,而不為SDS、胰酶和尿素所激活。
　　 生物化學(xué)和酶性質(zhì)檢測(cè)結(jié)果表明,毛蚶HbⅡ?qū)-DOPA底物的類PO活性的最適反應(yīng)溫度為40℃、最適反應(yīng)pH值為7.0,而HbⅠ對(duì)L-DOPA底物的類PO活性的最適反應(yīng)溫度為50℃、最適反應(yīng)pH值為7.0。HbⅡ和HbⅠ對(duì)L-DOPA、兒茶酚和對(duì)苯二酚均具有類PO

6、活性,但不能氧化酪氨酸和苯酚;在最適反應(yīng)條件下,HbⅡ?qū)-DOPA、兒茶酚和對(duì)苯二酚的Km值分別為1.22 mM、2.71 mM和0.97 mM,HbⅠ對(duì)L-DOPA、兒茶酚和對(duì)苯二酚的Km值分別為2.0 mM、5.27mM和1.55 mM,證明HbⅡ和HbⅠ均為同時(shí)具有兒茶酚酶與漆酶性質(zhì)的類PO。氧化酶抑制劑檢測(cè)結(jié)果顯示,亞硫酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸和半胱氨酸對(duì)HbⅡ和HbⅠ的類PO活性具有很強(qiáng)的抑制作用,而苯甲酸、苯硫脲和硫脲的抑制

7、作用較弱,表明毛蚶HbⅡ和HbⅠ發(fā)揮類PO活性時(shí)均更像是一種兒茶酚酶性質(zhì)的PO。金屬(酸)合劑和金屬離子檢測(cè)結(jié)果顯示,EDTA能強(qiáng)烈抑制HbⅡ和HbⅠ的類PO活性,DETC、Cu2+、Zn2+、Mg2+和Ca2+對(duì)其類PO活性具有不同程度的抑制作用,而Fe2+對(duì)其類PO活性則具有顯著的激活作用,且被EDTA抑制的類PO活性可被Fe2+完全回復(fù),說明毛蚶HbⅡ和HbⅠ均為金屬蛋白酶,與Hb是一種含F(xiàn)e蛋白的性質(zhì)是一致的。綜上所述,毛蚶Hb

8、Ⅱ和HbⅠ在發(fā)揮類PO活性時(shí)同時(shí)具有兒茶酚酶與漆酶雙重性質(zhì)且更像是一種兒茶酚酶的含F(xiàn)e金屬蛋白酶。
　　 對(duì)毛蚶Hb體外抗菌活性的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),毛蚶HbⅡ?qū)θN革蘭氏陽性菌——金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和四聯(lián)微球菌的MIC分別為0.373 mg/mL、0.186mg/mL和0.047 mg/mL,HbⅠ對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和四聯(lián)微球菌的MIC分別為1.910 mg/mL、0.060 mg/mL,和0.060 mg/mL,但二

9、者對(duì)大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌、鰻弧菌和哈維氏弧菌等革蘭氏陰性菌以及青霉、黑曲霉、面包酵母和裂殖酵母等真菌均沒有殺菌作用。以甲醚化海螢熒光素類似物(MCLA)為化學(xué)發(fā)光探針對(duì)毛蚶Hb抗菌機(jī)理的研究結(jié)果顯示,毛蚶HbⅡ和HbⅠ均能夠產(chǎn)生活性氧(ROS),且所產(chǎn)生的ROS可為超氧化物歧化酶(SOD)所特異性抑制,說明HbⅡ和HbⅠ所產(chǎn)生ROS的類型為超氧陰離子。由此可見,毛蚶HbⅡ和HbⅠ對(duì)革蘭氏陽性菌具有殺菌活性,其殺菌活性的分子機(jī)理是