先天性脊柱裂和肛門直腸畸形脊髓蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜差異分析.pdf

1、目的：先天性脊柱裂、先天性肛門直腸畸形均為常見(jiàn)的小兒先天性畸形，人群發(fā)生率分別為1％-5％、0.2％-0.7％，中國(guó)發(fā)生率明顯高于西方國(guó)家。根據(jù)目前研究結(jié)果普遍認(rèn)為先天性脊柱裂和先天性肛門直腸畸形均為多基因遺傳病，而且是內(nèi)在因素(遺傳因素)和環(huán)境因素(致畸因素)共同作用的結(jié)果。但是，這些畸形的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，病理改變復(fù)雜，而且沒(méi)有良好的預(yù)防和治療措施。因此，研究這些畸形的胚胎發(fā)生規(guī)律和早期診斷的方法，可以為畸形的早期治療和預(yù)防提供必要

2、的前期基礎(chǔ)，對(duì)減少出生缺陷、提高人口素質(zhì)具有極其重要意義。 經(jīng)過(guò)系列研究，我們證實(shí)先天性肛門直腸畸形大多數(shù)存在明顯的腰骶部脊髓神經(jīng)發(fā)育異常。利用藥物致畸制作動(dòng)物模型過(guò)程中我們也發(fā)現(xiàn)維甲酸和乙烯硫脲均可同時(shí)產(chǎn)生先天性脊柱裂、先天性肛門直腸畸形這兩種畸形。目前發(fā)現(xiàn)的畸形相關(guān)基因中Hox基因與這二種畸形均有關(guān)，SHH和Gli3基因是先天性脊柱裂和先天性肛門直腸畸形的共同相關(guān)基因。許多研究已經(jīng)證實(shí)口服葉酸可以預(yù)防神經(jīng)管畸形的發(fā)生，同時(shí)也

3、能減少肛門直腸畸形和四肢畸形的發(fā)生。因此，我們提出一個(gè)新的假設(shè)：先天性脊柱裂、先天性肛門直腸畸形可能存在共同的發(fā)生機(jī)制，它們的發(fā)生可能都是與胚胎期脊髓神經(jīng)發(fā)育異常有關(guān)。 蛋白質(zhì)組學(xué)是一個(gè)新興的研究領(lǐng)域，其核心在于大規(guī)模地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行綜合分析，通過(guò)對(duì)某物種、個(gè)體、器官、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)性質(zhì)包括表達(dá)水平、結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾、細(xì)胞內(nèi)定位、蛋白質(zhì)相互作用等的研究，對(duì)蛋白質(zhì)所執(zhí)行的生理性、病理性生命活動(dòng)做出最精細(xì)、最準(zhǔn)確、最本質(zhì)的闡述

4、。蛋白質(zhì)本身的存在形式、活動(dòng)規(guī)律仍依賴于直接對(duì)蛋白質(zhì)的研究來(lái)解決。因此，直接研究蛋白質(zhì)的變化具有不可替代的意義。而且，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展，基于固相pH梯度等電聚焦(IPG)的雙向凝膠電泳和各種質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組研究中的核心技術(shù)。以固相pH梯度等點(diǎn)聚焦為第一向的雙向電泳技術(shù)是當(dāng)前分辨率最高、信息量最大的電泳技術(shù)． 因此本研究將采用雙向電泳技術(shù)，研究?jī)煞N畸形動(dòng)物模型在胚胎發(fā)育階段的脊髓神經(jīng)組

5、織蛋白質(zhì)組的表達(dá)情況和變化規(guī)律，在蛋白質(zhì)水平探討兩種畸形之間的共同發(fā)生規(guī)律，為畸形的胚胎早期診斷和治療提供基礎(chǔ)資料。 方法： 1、建立脊柱裂、肛門直腸畸形大鼠胚胎模型 (1)將孕10d大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，按160mg/Kg體重用灌胃法給予實(shí)驗(yàn)組大鼠，對(duì)照組給予相應(yīng)體積橄欖油。 (2)孕21d剖腹取出胚胎，取出脊髓組織(范圍：第12胸椎下緣至脊髓末端)。 2、模型胎鼠與對(duì)照胎鼠脊髓組織蛋白質(zhì)

6、雙向電泳圖譜差異分析 (1)提取胎鼠脊髓組織的總蛋白質(zhì)，Bradford法進(jìn)行蛋白定量。 (2)等電聚焦使用Ettan IPGphor Ⅱ等電聚焦儀。聚焦后的膠條經(jīng)兩步平衡后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，銀染、掃描后用ImageMaster 2D Platinum 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，尋找差異蛋白點(diǎn)。 結(jié)果： 1、成功制作了脊柱裂、肛門直腸畸形大鼠胚胎模型 孕21d剖檢共獲取胎鼠127只。對(duì)照組2

7、0只，維甲酸組中剖出存活胎鼠96只，死胎及吸收胎11只，其中給藥無(wú)畸形組19只，單純肛門直腸畸形組29只，肛門直腸畸形合并腰骶部顯性脊柱裂組28只。 2、維甲酸組胎鼠和對(duì)照組胎鼠脊髓組織雙向電泳圖譜差異分析 結(jié)果使用pH3～10，24cm膠條獲得分離較好的蛋白表達(dá)圖譜。對(duì)照組獲得可識(shí)別平均斑點(diǎn)數(shù)為1355±30個(gè)，給藥無(wú)畸形組1425±48個(gè)，單純肛門直腸畸形組1340±55個(gè)，肛門直腸畸形合并腰骶部顯性脊柱裂組1056