嗜酸氧化亞鐵硫桿菌外膜蛋白的快速有效分離及雙向電泳圖譜的建立.pdf

1、嗜酸氧化亞鐵硫桿菌是革蘭氏陰性、化能自養(yǎng)菌，能通過(guò)氧化Fe2+、各種還原性硫化物以及H2提供生長(zhǎng)能量。外膜蛋白是嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的重要組成成分，在物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信息識(shí)別、細(xì)胞吸附等方面起著重要作用。外膜蛋白的分離是對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究的必要條件，但是傳統(tǒng)的分離方法耗時(shí)長(zhǎng)、儀器設(shè)備要求高、步驟繁多，同時(shí)很難嚴(yán)格地將質(zhì)膜蛋白與外膜蛋白區(qū)分開來(lái)。 本論文以大腸桿菌為模式菌，運(yùn)用溫度誘導(dǎo)的雙水相萃取分離技術(shù)建立了一種快速、有效的分離革蘭氏陰

2、性細(xì)菌外膜蛋白的方法體系。系統(tǒng)地研究了不同濃度的Triton X-114對(duì)外膜蛋白提取效率的影響，結(jié)果表明8％的Triton X-114為外膜蛋白分離的合適濃度。為摸索Triton X-114的最佳處理時(shí)間，以8％的Triton X-114分別處理未經(jīng)機(jī)械破碎的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌1h、2h、3h、4h、5h，發(fā)現(xiàn)處理3h后外膜蛋白的提取效率達(dá)到最佳。分離得到的蛋白質(zhì)樣品，經(jīng)透析除鹽處理后，可用于雙向電泳分析。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雙向電泳樣品

3、裂解液中包含低濃度的Tris是外膜蛋白雙向電泳成功的關(guān)鍵，CHAPS與ASB-14或NP-40結(jié)合使用比單獨(dú)使用CHAPS效果更佳，可顯著提高外膜蛋白的溶解能力，增加蛋白斑點(diǎn)，縮短聚焦時(shí)間，從而優(yōu)化了外膜蛋白雙向電泳技術(shù)體系，建立了外膜蛋白雙向電泳圖譜。 采用優(yōu)化后的雙水相萃取分離體系選擇性分離了嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的外膜蛋白。對(duì)所分離到的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行了雙向電泳分析，并建立了不同能源基質(zhì)培養(yǎng)條件下嗜酸氧化亞鐵硫桿菌外膜蛋白的雙向