百草枯對(duì)人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞氧化損傷機(jī)制的研究.pdf

1、百草枯(Paraquat，PQ)是全球使用廣泛的除草劑。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PQ暴露可導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是公認(rèn)的神經(jīng)毒物。發(fā)育中的腦對(duì)外源性有毒物質(zhì)特別敏感，極易受到損傷。而PQ可穿透血腦屏障，影響腦組織的正常代謝及功能。多項(xiàng)研究也證明PQ可對(duì)多種神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，于是PQ所致神經(jīng)發(fā)育毒性越來越得到關(guān)注。盡管PQ致神經(jīng)毒性的具體機(jī)制尚不完全清楚，但大量研究表明PQ導(dǎo)致的氧化損傷在其中起到了重要的作用。
　　神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更

2、新和多向分化潛能，離體培養(yǎng)技術(shù)的成熟也使其逐漸成為研究神經(jīng)發(fā)育毒性機(jī)制的理想模型。很多外源性化學(xué)物可通過干擾神經(jīng)干細(xì)胞的正常增殖過程影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡都對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖狀態(tài)起到了重要作用。本研究利用人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞系，觀察百草枯引起的氧化應(yīng)激對(duì)其增殖活力的影響，并探討其對(duì)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及抗氧化通路的分子機(jī)制。
　　一百草枯致ReNcell CX細(xì)胞的氧化損傷及Nrf2-Keap1/ARE通路在其中的作

3、用
　　利用MTT法檢測(cè)PQ染毒24h對(duì)ReNcell CX細(xì)胞活力的影響。采用檢測(cè)試劑盒檢測(cè)染毒后細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性和丙二醛(MDA)的含量以及培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)的活力。利用western blot法測(cè)定染毒后Nrf2信號(hào)通路中關(guān)鍵分子Nrf2、Keap1以及蛋白激酶PKC和CKⅡ蛋白表達(dá)情況。利用RT-PCR測(cè)定下游基因HO-1

4、、NQO1mRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果顯示，PQ可使細(xì)胞活力下降，到100μM時(shí)可顯著抑制細(xì)胞活力。PQ可在無明顯細(xì)胞毒性劑量下已顯著提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平（PQ≥10μM）。細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GPx的活力逐漸下降，到100μM時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。培養(yǎng)液中LDH活力隨PQ濃度升高而上升，到10μM時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞內(nèi)丙二醛含量逐漸升高，到10μM時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PQ可顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Nrf2、Keap1蛋白表達(dá)以

5、及HO-1、NQO1mRNA的表達(dá)。隨PQ濃度上升，細(xì)胞中CKⅡ和PKC蛋白水平顯著增加。
　　這些結(jié)果提示，PQ可介導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)失衡，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。PQ引起的氧化應(yīng)激能激活Nrf2-Keap1/ARE信號(hào)通路，影響下游抗氧化酶基因的表達(dá)。CKⅡ和PKC蛋白參與了Nrf2磷酸化修飾的激活過程。二百草枯對(duì)ReNcell CX細(xì)胞增殖及凋亡的影響
　　利用EdU法測(cè)定染毒母代及子代兩代細(xì)胞的增殖情

6、況，利用PCR測(cè)定染毒母代及子代兩代細(xì)胞p53、p16、p21mRNA的表達(dá)情況。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，western blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞色素C、caspase3及caspase9的表達(dá)。
　　結(jié)果顯示，在1μM時(shí)，染毒母代及子代兩代中處于S期的細(xì)胞占活細(xì)胞的比例已出現(xiàn)顯著下降。PQ在1μM時(shí)已顯著上調(diào)p53、p16、p21mRNA的表達(dá)，并且這一上調(diào)作用可在子代細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)。在1μM時(shí)PQ可誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)

7、早期及晚期凋亡。1μM時(shí)caspase3蛋白表達(dá)水平顯著上升，在10μM細(xì)胞色素C及caspase9蛋白水平顯著上升。
　　這些結(jié)果提示，PQ可抑制ReNcell CX細(xì)胞的增殖活力，在未引起細(xì)胞活力下降時(shí)已顯著抑制其增殖，并且這種抑制可持續(xù)到后代細(xì)胞。PQ可誘導(dǎo)p53介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換，從而抑制細(xì)胞增殖。此外PQ可激活線粒體通路，誘導(dǎo)早期及晚期凋亡。p53同時(shí)參與了細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的調(diào)控。
　　結(jié)