百草枯對人肝HepG2細(xì)胞的毒理學(xué)研究.pdf

1、百草枯(PQ)是一種水溶型除草劑，因其易于被土壤吸附、在環(huán)境中殘留量相對較低和具有良好的除草效果，PQ先后在全球120多個(gè)國家被廣泛使用。但自1962年注冊生產(chǎn)以來，PQ已經(jīng)引起了嚴(yán)重的公共健康問題，由 PQ導(dǎo)致的自殺、謀殺、誤服以及生產(chǎn)和使用接觸的中毒死亡事件時(shí)有報(bào)道，而PQ的毒性機(jī)制至今仍不清楚，目前針對PQ中毒也沒有的良好治療策略和高效解毒劑。
　　通過對PQ中毒病人、死者和動(dòng)物進(jìn)行研究，人們發(fā)現(xiàn)體內(nèi)蓄積的PQ主要存在于肺，

2、而腎作為水溶物質(zhì)的排泄器官，其在PQ中毒之后發(fā)生的變化也被大量調(diào)查。此外，近年來的慢性毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PQ引起的部分病理特征與一些早老疾病癥狀相似，隨之PQ的神經(jīng)毒性也引起了人們的廣泛關(guān)注。但PQ中毒對人肝的影響一直未被深入探討。
　　眾所周知，肝是機(jī)體最重要的解毒器官，在外源毒物的降解過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，因此解明肝在PQ處理后發(fā)生的變化對全面理解PQ的毒性效應(yīng)及機(jī)制具有重要意義，也有利于尋找新的方法提高肝對PQ的抵抗力、增

3、強(qiáng)肝對PQ中毒的消解作用。人肝癌細(xì)胞 HepG2具有肝細(xì)胞的多種代謝和轉(zhuǎn)化酶系，是良好的肝細(xì)胞研究模型，故本文以 HepG2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，運(yùn)用一系列細(xì)胞和分子生物學(xué)新技術(shù)開展研究，探討PQ對HepG2細(xì)胞的毒性效應(yīng)及可能機(jī)制。
　　首先，本研究從細(xì)胞水平上，采用6種方法，選擇存活力、生長狀況、周期、凋亡和突變5個(gè)指標(biāo)評估了PQ處理24 h對HepG2細(xì)胞的毒性效應(yīng)。其中，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PQ對HepG2細(xì)胞存活力的24 h-

4、IC50為51.17 mg/L，顯微觀察發(fā)現(xiàn)7.21 mg/L的PQ即可導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生病理性改變、貼壁能力下降、生長受到抑制，BrdU和PI雙色流式實(shí)驗(yàn)檢測到23.36 mg/L的PQ即可導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯(S期細(xì)胞減少、G1和G2期細(xì)胞增多)，annexin V和PI雙色流式實(shí)驗(yàn)檢測到7.21 mg/L的PQ即可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，微核(MN)和姊妹染色單體交換(SCE)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明7.21 mg/L的PQ可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞的突變率

5、大大提高，HepG2細(xì)胞發(fā)生的這些毒性效應(yīng)的程度均與PQ處理濃度呈正相關(guān)。此外，本研究在MN實(shí)驗(yàn)操作之前對HepG2細(xì)胞進(jìn)行了低滲處理，結(jié)果提高了MN圖像的分辨力，這對于增加同類細(xì)胞MN實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確率和效率均具有重要意義。
　　隨后，本研究從分子水平上，調(diào)查了PQ處理24 h對HepG2細(xì)胞基因組DNA穩(wěn)定性的影響，以分析PQ對HepG2細(xì)胞毒性效應(yīng)的可能機(jī)制。單細(xì)胞凝膠電泳、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性和高效液相色譜(HPLC)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，P

6、Q可導(dǎo)致HepG2細(xì)胞發(fā)生明顯的基因組DNA斷裂損傷、多態(tài)性下降和甲基化升高，且基因組的這些變化與PQ處理濃度呈正相關(guān)。定量PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，HepG2細(xì)胞內(nèi)抑制斷裂雙鏈DNA(dsDNA)進(jìn)行同源重組(HR)修復(fù)的細(xì)胞因子BLM和DNA ligase I的表達(dá)量隨PQ處理濃度增大而減少，即PQ處理后HR修復(fù)增強(qiáng)，這表明HepG2細(xì)胞對PQ導(dǎo)致的基因組不穩(wěn)定有明顯的應(yīng)激反應(yīng)，該反應(yīng)也合理地解釋了PQ導(dǎo)致的SCE頻率增高；而

7、HepG2細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)斷裂dsDNA進(jìn)行非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)的細(xì)胞因子Ku70的表達(dá)量隨PQ處理濃度增大呈先增多后減少變化，NHEJ修復(fù)的先增強(qiáng)顯然也是HepG2細(xì)胞對PQ導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，但后減弱則意味著NHEJ修復(fù)最終走向崩潰，難以挽救PQ導(dǎo)致的基因組不穩(wěn)定。
　　進(jìn)一步，采用流式細(xì)胞術(shù)、HPLC和 ELISA等方法系統(tǒng)評價(jià)了 PQ處理后 HepG2細(xì)胞發(fā)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)和氧化損傷。結(jié)果顯示，低濃度PQ

8、處理組HepG2細(xì)胞超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力有所提高，所有PQ處理組HepG2細(xì)胞內(nèi)氧化型谷胱甘肽含量均增多，表明 HepG2細(xì)胞對 PQ導(dǎo)致的氧化損傷產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)；但同時(shí)發(fā)現(xiàn)所有PQ處理組HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧和丙二醛含量均較多，表明氧化應(yīng)激反應(yīng)不足以平衡氧化損傷；因此同時(shí)檢測到PQ處理組DNA氧化產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷的含量明顯多于正常組。DNA發(fā)生氧化損傷可能正是PQ導(dǎo)致HepG2細(xì)胞基因組不穩(wěn)定的直接原因。
　　最后

9、，采用火焰原子吸收法檢測到PQ處理導(dǎo)致HepG2細(xì)胞內(nèi)Ca、Mg和Zn含量失衡。其中，Ca的含量增加可能是Ca活化途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的體現(xiàn)，不利于細(xì)胞存活；Mg含量的減少則會(huì)阻滯細(xì)胞生長和分裂，同時(shí)不利于基因組的穩(wěn)定；而Zn含量的減少不僅會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而且不利于基因組穩(wěn)定性的維持和DNA氧化損傷的防止。
　　綜上所述，PQ處理可能首先導(dǎo)致HepG2細(xì)胞發(fā)生了嚴(yán)重的DNA氧化損傷和Ca、Mg及Zn含量的失衡，進(jìn)而引起基因組穩(wěn)定性下降