骨髓間充質(zhì)干細胞在大鼠百草枯中毒肺損傷中的實驗研究.pdf

1、第一部分:SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)、純化及其生物學(xué)特性鑒定的研究
　　 目的:探討SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal SstemCells，BMSCs)體外分離、純化和培養(yǎng)方法，并鑒定其生物學(xué)特性，建立理想的大鼠BMSCs體外分離培養(yǎng)體系，為BMSCs實驗研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:取4-6周齡的清潔級雄性SD大鼠，無菌條件下分離大鼠后肢，PBS沖洗骨髓腔，

2、收集骨髓。聯(lián)合運用密度梯度離心法和全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離、純化和培養(yǎng)SD大鼠BMSCs。光鏡下進行細胞形態(tài)學(xué)觀察、采用MTT法繪制細胞生長曲線、應(yīng)用流式細胞術(shù)測定細胞表面標(biāo)記，并檢測BMSCs向成骨、成脂肪細胞分化的潛能。
　　 結(jié)果:顯微鏡下體外分離培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs呈梭形、成纖維細胞樣形態(tài)，大小均一，漩渦狀生長。細胞生長曲線呈“S”形。P3代SD大鼠BMSCs純度達98％以上;細胞表面表達CD44、CD90等抗原分子，不

3、表達CD34抗原。誘導(dǎo)P3代BMSCs可向成骨細胞及成脂肪細胞分化。
　　 結(jié)論:本實驗建立起了一種理想的大鼠BMSCs體外分離培養(yǎng)體系。根據(jù)這種方法培養(yǎng)出的大鼠BMSCs純度高、生物學(xué)特征穩(wěn)定，可用于對BMSCs的實驗研究。
　　 第二部分:骨髓間充質(zhì)干細胞在大鼠百草枯中毒肺損傷中的療效觀察
　　 目的:探討骨髓間充質(zhì)干細胞在大鼠百草枯中毒致肺損傷中的保護作用，比較不同劑量骨髓間充質(zhì)干細胞在治療大鼠百草枯中毒致

4、肺損傷療效之間的差異;方法:清潔級雄性SD大鼠150只（200±508/只），隨機分5組，每組30只:A組:百草枯染毒組;B組:高劑量BMSCs治療組。C組:低劑量BMSCs治療組;D組:BMSCs對照組;E組:正常對照組。觀察各組大鼠28d內(nèi)生存率，并于染毒后3、7、14、21、28天每組隨機選取6只大鼠處死，留取血液與肺組織標(biāo)本，以雙抗夾心ELISA法檢測血漿IL-10、ICAM-1、MDA、SOD、GSH-PX、MMP-9、TGF

5、-β的含量，堿水法檢測肺組織HYP含量、Western Blot法檢測肺組織a-SMA蛋白含量，采用HE、MASON、天狼星紅染色不同方法觀察肺組織病理學(xué)改變，比較各組大鼠不同時間點上述各指標(biāo)間的差異;結(jié)果:A、B、C三組與D、E兩對照組相比，各檢測指標(biāo)在各時間點均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。與A組相比，B、C兩組均降低了大鼠死亡率，但只有B組有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);B、C兩組明顯升高了炎癥介質(zhì)IL-10的含量，降低了ICAM-

6、1、MDA、MMP-9、TGF-β水平，同時使SOD、GSH-PX的水平顯著升高。B組在第3、7、14、21和28天各時間點與A組相比統(tǒng)計學(xué)有明顯差異(P＜0.01)，C組僅在第3、7天有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。相比于A組，B、C兩組還降低了肺組織中HYP的含量和濕干比，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。與正常組相比，HE染色提示3-7天內(nèi)A組肺泡腔內(nèi)有大量紅細胞聚集，部分肺組織區(qū)域出血明顯，MASON及天狼星紅染色提示14-28天部

7、分肺泡腔破壞或消失，逐漸出現(xiàn)部分肺泡間隔纖維性增厚，間質(zhì)內(nèi)少量成纖維細胞增生等修復(fù)機化改變。B組和C組肺泡腔內(nèi)病理變化及肺纖維化程度比百草枯組明顯減輕，但B組更為明顯。B、C組肺組織W/D比值較A組顯著降低(P＜0.05);B、C組肺組織a-SMA蛋白含量明顯低于百草枯組。結(jié)論:骨髓間充質(zhì)干細胞對百草枯誘導(dǎo)大鼠肺損傷模型中出現(xiàn)的肺泡炎和肺纖維化具有潛在的抑制作用，高劑量、多頻次應(yīng)用BMSCs進行干預(yù)效果更明顯，且提高了百草枯中毒大鼠生存

8、率，其作用機制可能與其減少肺泡壁Ⅰ和Ⅲ型膠原及TGF-β的表達有關(guān)。
　　 第三部分:骨髓間充質(zhì)干細胞體內(nèi)示蹤研究
　　 目的:通過動物活體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)對骨髓間充質(zhì)干細胞在百草枯中毒誘導(dǎo)大鼠肺損傷實驗中的歸巢過程進行示蹤。方祛:1、4W齡SD大鼠，SPF級60只(200±50g/只)，隨機數(shù)字表法分為6組，每組10只:A組:百草枯染毒組（腹腔注射20％百草枯溶液15mg/kg，尾靜脈注射1.5mlPBS。）;B組:高劑

9、量BMSCs治療組（百草枯注射同A組，分別于造模后4h、第3天、第7天經(jīng)尾靜脈注射BMSCs，2.0×106/只，重懸于1.5mlPBS中）。C組:低劑量BMSCs治療組（百草枯注射同A組，僅于造模后4h經(jīng)尾靜脈注射BMSCs，1.0×106/只，重懸于1.5 mlPBS中）;D組:BMSCs對照組（腹腔注射等量PBS，4h后尾靜脈注射BMSCs，2.0×106/只，重懸于1.5mLPBS中）;E組:正常對照組;F組:DiR染料對照組（

10、腹腔注射等量PBS，4h后尾靜脈注射等量DiR染料）;2、復(fù)蘇傳代大鼠BM-MSCs，采用IVIS直觀觀察DiR-BM-MSCs;3、各組大鼠在BMSCs移植后10min、1h、4h、24h、48h、72h進行體外熒光成像。4、各組在上述條件干預(yù)后于第1d、第3d、第7d隨機處死5大鼠，取右下肺組織快速冰凍處理，行常規(guī)HE染色，熒光倒置顯微鏡下觀察BMSCs在大鼠體內(nèi)的遷移與定植。結(jié)果:1、復(fù)蘇傳代后的SD大鼠BM-MSCs狀態(tài)良好，經(jīng)

11、DiR熒光染料染色后細胞形態(tài)無變化，正常生長且發(fā)光效果穩(wěn)定，隨細胞濃度的增加，熒光強度與其成相關(guān)性增加;2、各組大鼠體內(nèi)成像:A組大鼠體表未見發(fā)光;B組可見雙肺及腹部紅色激發(fā)光，色澤鮮艷且分布均勻，時間可持續(xù)至72h;C組可見單側(cè)肺部及腹部紅色激發(fā)光，但顏色與B組略顯暗淡時間可持續(xù)24h;D組體表仍可見紅色激發(fā)光，但發(fā)光部位不穩(wěn)定，亮度減弱;E組未見發(fā)光;3、BMSCs各組大鼠體外定植示蹤:熒光倒置顯微鏡下見:A、E組未見紅色熒光，A組

12、肺組織問隔增厚，明顯纖維疤痕形成，肺泡壁顯著增厚，膠原纖維增多，E組結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔開放，肺泡壁薄完整，腔內(nèi)無炎性細胞浸潤;B組可見紅色熒光，明顯可見一定數(shù)量分布均勻、形態(tài)規(guī)則的BMSCs嵌合于肺泡及肺間隔組織中，經(jīng)三個時間點三次干細胞移植，B1、B2、B3各時間點發(fā)光強度隨濃度的增加而增加，細胞數(shù)量也呈逐步遞升趨勢，細胞形態(tài)也趨于完整，尤其是B3組可見多個細胞融合，包膜、包漿及細胞核清晰可見;C組也可見紅色熒光及完整的細胞形態(tài)，但亮度