卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)對小鼠腎臟疾病相關(guān)印記基因表達及甲基化狀態(tài)的影響.pdf

1、自1978年人類首例體外受精（in vitro fertilization and embryo transfer, IVF）嬰兒出生以來，以IVF和卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)為主流技術(shù)的輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive techonologies，ART）已經(jīng)成為越來越多不孕家庭選擇的不孕癥治療技術(shù)。ART子代的健康狀況，尤其是ICSI子代的

2、健康已經(jīng)成為ART技術(shù)安全性的研究熱點之一。
　　ICSI技術(shù)主要針對男性少、弱、畸精子癥患者，這些患者因精子數(shù)量過少或形態(tài)功能障礙，不能穿透卵母細胞透明帶，無法完成精卵融合，因而無法完成受精過程或?qū)е率芫曙@著下降。ICSI技術(shù)不僅包括配子和胚胎的體外培養(yǎng)的過程，且其受精過程是通過顯徼注射系統(tǒng)人為選擇精子，并直接將其注入卵細胞胞漿內(nèi)。人為選擇精子意味著避開了卵子對精子的自然選擇機制，同時，注射過程可對卵子形成輕微的機械性損傷，并

3、帶入一些異源性物質(zhì)，如聚乙烯吡咯酮等，這些操作可能對配子的受精和后續(xù)胚胎的分化和發(fā)育產(chǎn)生影響。
　　從ICSI技術(shù)開展以來，陸續(xù)有大規(guī)模流行病學研究報導ICSI子代存在出生缺陷的風險較正常兒童高，但子代出現(xiàn)生長發(fā)育異常的機制目前尚未明確。研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物的發(fā)育先后經(jīng)歷兩次全基因組DNA甲基化重新編程:第一次在原始生殖細胞發(fā)育期全基因組范圍內(nèi)去甲基化，而后在配子成熟過程中重新獲得甲基化;第二次發(fā)生在胚胎植入前基因組DNA再次發(fā)生去甲

4、基化，印記基因則逃避了去甲基化過程，其甲基化水平維持不變。ICSI技術(shù)不僅涉及配子短期體外培養(yǎng)過程，而且在卵子MⅡ期干擾了其正常受精過程并涉及植入前胚胎發(fā)育過程，因此可能對印記基因甲基化狀態(tài)的獲得和維持產(chǎn)生影響。對ICSI子代研究發(fā)現(xiàn)差異甲基化區(qū)(differentially methylated region，DMR)的甲基化修飾改變可能是導致其出生缺陷的原因之一。
　　已有的回顧性流行病學調(diào)查表明ICSI子代存在泌尿道畸形發(fā)生

5、率升高的趨勢，同時，已知一些印記基因，如MEST、H19、IGF2、PEG3、SNRPN、CDKNLC、SOCS-3、SFRP1、RASAL1等，與腎臟發(fā)育缺陷、腎臟纖維化及腎臟腫瘤性疾病的發(fā)生關(guān)系密切。ICSI技術(shù)是否可通過干擾腎臟基因印記而影響ICSI子代腎臟疾病的發(fā)生是有待解答的ART安全性問題之一。
　　本研究建立ICSI小鼠模型（實驗組）和2細胞胚胎移植小鼠模型（對照組），比較分析ICSI出生小鼠與對照小鼠子代父源印記基

6、因H19以及母源印記基因Igf2、Snrpn、Mest和Peg3的表達差異，檢測了相關(guān)印記基因DMR的甲基化狀態(tài)，分析了ICSI技術(shù)對子代腎臟疾病相關(guān)印記基因表達的影響，探究了相關(guān)印記基因表達異常可能存在的表觀遺傳學機制，為ICSI技術(shù)的安全性評估理論依據(jù)。
　　第一部分 ICSI技術(shù)對小鼠腎臟疾病相關(guān)印記基因H19、Igf2、Mest、Peg3和Snrpn的表達的影響
　　目的:建立ICSI小鼠模型（實驗組）和2細胞胚胎移

7、植小鼠模型（對照組），研究ICSI子代小鼠腎臟中腎臟疾病相關(guān)印記基因H19、Igf2、Mest、Peg3和Snrpn的表達與2細胞胚胎移植組子代是否存在差異，闡明ICSI技術(shù)對目的印記基因表達的影響。
　　方法:利用C57BL/6J小鼠，建立ICSI小鼠模型和2細胞胚胎移植小鼠模型，出生小鼠飼養(yǎng)至成年期（10周）和老年期（1.5年），收集兩組小鼠的腎臟組織，兩個時期各自收集ICSI小鼠腎臟8例和2細胞胚胎移植小鼠腎臟10例，比較兩

8、組小鼠及其腎臟的重量，并采用逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR檢測腎臟中目的基因mRNA的表達水平。
　　結(jié)果:在成年子代中，ICSI小鼠腎臟中H19、Mest、Peg3和Snrpn的表達水平較對照組均顯著上調(diào)。而Igf2的表達水平無顯著差異。而在老年子代中，ICSI組Snrpn較對照組呈顯著下調(diào)，而其余4個基因與對照組相比無顯著差異。
　　結(jié)論:ICSI子代腎臟中存在印記基因H19、Mest、Peg3和Snrpn的表達異常，可能影響

9、ICSI子代腎臟疾病的發(fā)生。
　　第二部分 ICSI技術(shù)對小鼠腎臟中H19DMR、MestDMR、Peg3DMR和SnrpnDMR的甲基化水平的影響
　　目的:研究ICSI子代腎臟中H19DMR、MestDMR、Peg3DMR和SnrpnDMR的甲基化狀態(tài)，比較其與對照組之間的差異，并探索其與基因表達間的關(guān)系。
　　方法:選擇成年期和老年期收集的小鼠腎臟組織，兩個時期各自收集ICSI小鼠腎臟8例和2細胞胚胎移植小鼠腎臟

10、10例，采用亞硫酸鹽處理后克隆測序(bisulfitesequencing，BSP)法檢測ICSI組與對照組H19DMR和SnrpnDMR的DNA甲基化狀態(tài)，并采用焦磷酸鹽測序法對其中部分CpG位點進行驗證，同時采用焦磷酸鹽測序法對MestDMR和Peg3DMR區(qū)DNA甲基化狀態(tài)進行檢測。
　　結(jié)果:成年ICSI子代腎臟H19DMR、MestDMR、Peg3DMR甲基化水平較對照組均顯著降低，與其調(diào)控的基因的表達量較對照組升高均相

11、符;成年ICSI子代腎臟SnrpnDMR甲基化水平與對照組呈現(xiàn)降低趨勢，但未達到統(tǒng)計學顯著性差異;老年ICSI子代腎臟SnrpnDMR甲基化水平呈顯著升高，與Snrpn基因的相對表達量降低相符。
　　結(jié)論:成年ICSI子代腎臟中H19、 Mest、Peg3基因mRNA表達水平上調(diào)可能與基因DMR的甲基化水平改變有關(guān)，老年ICSI子代腎臟中Snrpn基因的相對表達量降低也可能與其DMR高甲基化水平相關(guān)。ICSI技術(shù)可能干擾了早期配子