三拗湯治療支氣管哮喘的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、三拗湯出自《太平惠民和劑局方·卷二》，方以麻黃為君，杏仁為臣，甘草調(diào)和麻杏宣降，配伍精當(dāng)，主治感冒風(fēng)邪，鼻塞聲重，語(yǔ)音不出；或傷風(fēng)傷冷，頭痛目眩，四肢拘倦，咳嗽多痰，胸滿(mǎn)氣短：現(xiàn)代臨床報(bào)道以三拗湯及其類(lèi)方治療感冒、支氣管炎、支氣管哮喘、咳嗽變異性哮喘及慢性咽炎引起的咽干、咽癢、干咳無(wú)痰或少痰等上呼吸道疾病。為了闡明傳統(tǒng)藥物治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，探索中藥復(fù)方的化學(xué)的研究方法，本文選取本方為主要對(duì)象，進(jìn)行了較系統(tǒng)的化學(xué)成分和分析方面的研究，同

2、時(shí)對(duì)其三個(gè)類(lèi)方進(jìn)行藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，并對(duì)它們進(jìn)行了藥理活性評(píng)價(jià)。 以三拗湯及其類(lèi)方三拗湯加味，五拗湯和七拗湯的水煎劑揮發(fā)油為研究對(duì)象，運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)、計(jì)算機(jī)檢索結(jié)合人工解析，從三拗湯揮發(fā)油中鑒定出50個(gè)化合物；從三拗湯加味揮發(fā)油中鑒定出86個(gè)化合物；從五拗湯揮發(fā)油中鑒定出105個(gè)化合物；從七拗湯揮發(fā)油中鑒定出84個(gè)化合物。其中復(fù)方中的主要成分基本來(lái)源于其組方藥材中的揮發(fā)性成分，但各方中皆有部分成分在單

3、味藥的揮發(fā)油中并未檢測(cè)到。為建立分析測(cè)定復(fù)方揮發(fā)性成分的方法奠定了基礎(chǔ)。 觀察三拗湯類(lèi)方揮發(fā)油部分對(duì)呼吸道合胞病毒（RSV）誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥和Th1/Th2亞群平衡性的影響，比較各方的作用效果，篩選出最佳對(duì)證方劑。以45、135、405μg/mL Ach濃度激發(fā)時(shí)，與PBS對(duì)照組比，OVA/RSV組RL增高值（與基值比較）均明顯升高（P<0.05，P<0.01）；BALF中細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞炎性細(xì)

4、胞均顯著升高（P均<0.01）；BALF上清夜中IFN-γ及IL-4、IL-5含量均升高（P<0.01），其中IL-4、IL-5含量升高更為明顯（P均<0.01）；OVA/RSV組的肺組織病變程度十分嚴(yán)重（P均<0.01）。應(yīng)用藥物后氣道反應(yīng)性均顯著降低（P<0.05，P<0.01）；各給藥組細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量與OVA/RSV組比均明顯降低（P均<0.01），其中中性粒細(xì)胞降低更為顯著（P均<0.01）；各給

5、藥組IFN-γ、IL-4、IL-5的含量均較OVA/RSV組明顯降低（P<0.05，P<0.01）；藥物應(yīng)用后能減輕支氣管周?chē)椎牟∽兂潭?；其中七拗湯揮發(fā)油部位對(duì)各種指證哮喘的指標(biāo)均有較強(qiáng)的抑制作用。 對(duì)三拗湯化學(xué)成分利用各種色譜、光譜方法進(jìn)行系統(tǒng)分離和結(jié)構(gòu)鑒定，共得到化合物12個(gè)并鑒定了它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)，包括糖苷類(lèi)2個(gè)，苦杏仁苷及甘草酸；黃酮類(lèi)3個(gè)，芒柄花素，甘草素和異甘草素；甾醇類(lèi)1個(gè)，β-谷甾醇；有機(jī)酸類(lèi)3個(gè)，苯甲酸，琥珀酸

6、及正三十烷酸；生物堿類(lèi)2個(gè)，麻黃堿及偽麻黃堿：以及苦杏仁苷的水解產(chǎn)物扁桃腈。其中所有化合物均為首次從三拗湯中分離得到。并對(duì)三拗湯各部位及所得到的化合物進(jìn)行過(guò)氧化物酶體增值物激活受體PPARγ激動(dòng)活性研究，其中三拗湯的乙酸乙酯、正丁醇部位都有一定活性，化合物中芒柄花素、甘草素、異甘草素有較強(qiáng)活性，以芒柄花素的活性最好，與陽(yáng)性藥物曲格列酮激活作用相當(dāng)，為天然的PPARγ受體。 采用HPLC/ESI-MS聯(lián)用技術(shù)分析三拗湯及其類(lèi)方效應(yīng)

7、部位，通過(guò)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，紫外吸收光譜推測(cè)出其中34個(gè)主要成分的可能結(jié)構(gòu)，并與對(duì)照品比對(duì)，確認(rèn)甘草素、異甘草素、芒柄花素及苯甲酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。根據(jù)此實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用HPLC技術(shù)對(duì)三拗湯及其類(lèi)方進(jìn)行了在線(xiàn)分析，同時(shí)測(cè)定三拗湯及其類(lèi)方中有效部位的效應(yīng)成分扁桃腈、苯甲酸、甘草素、異甘草素和芒柄花素濃度分別在5.3～106，1.1～22，2.1～41.2，0.60～11.9，0.16～3.28μg/mL范圍內(nèi)均呈良好線(xiàn)性關(guān)系（r≥0.9998）；各組分低

8、、中、高濃度的平均加樣回收率均在99.0～101之間，RSD均小于2.0％。重復(fù)性良好，RSD均小于1.5％（n=6）。HPLC方法測(cè)定三拗湯及其類(lèi)方效應(yīng)部位中不同類(lèi)型的5個(gè)組分的含量，方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性良好，為方劑中多種類(lèi)型復(fù)雜效應(yīng)物質(zhì)的分析評(píng)價(jià)提供了參考。 論文主要特色及創(chuàng)新點(diǎn)： 1.在本課題實(shí)施過(guò)程中逐步形成了從藥材-方劑-類(lèi)方的研究思路和基本認(rèn)識(shí)，從中探索揭示方劑及類(lèi)方配伍規(guī)律和科學(xué)內(nèi)涵的有效途徑。 2

9、.首次運(yùn)用GC-MS的方法以分區(qū)段方式對(duì)三拗湯、三拗湯類(lèi)方以及十味組方藥材的揮發(fā)性成分進(jìn)行系統(tǒng)的比較分析。并研究三拗湯及其類(lèi)方的揮發(fā)性成分對(duì)RSV誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥和Th1/Th2亞群平衡性的影響，比較各方的作用效果，層層遞進(jìn)，揭示復(fù)方中單味藥材與復(fù)方的關(guān)系，篩選出最佳對(duì)證方劑。 3.通過(guò)生物效應(yīng)跟蹤評(píng)價(jià)，闡明三拗湯效應(yīng)部位中激動(dòng)PPARγ的主要活性成分可能為芒柄花素、甘草素和異甘草素。采用HPLC/ESI-MS，對(duì)三拗湯效