結(jié)締組織生長因子在糖尿病腎病發(fā)病中的作用及己酮可可堿對其表達影響的研究.pdf

1、目的：轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）被認為是糖尿病腎?。―N）致纖維化因子中最為重要的一個，在介導DN的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用，但是TGF-β強大的抗炎抗腫瘤效應(yīng)限制了其作為DN治療靶點的應(yīng)用。結(jié)締組織生長因子（CTGF）作為TGF-β重要的下游效應(yīng)分子介導了TGF-β的致纖維化作用而并不介導其抗炎抗腫瘤的有利作用，這就使得CTGF成為DN治療的最佳干預位點。因此研究TGF-β-CTGF通路、探討CTGF在DN發(fā)生發(fā)展中的重要作用及尋找

2、可以抑制CTGF表達而對TGF-β表達沒有影響的藥物，對于研究DN的干預治療有重要意義。本課題應(yīng)用體外培養(yǎng)腎小球系膜細胞的方法來研究高糖誘導CTGF表達的機制及糖尿病大鼠模型體內(nèi)實驗研究CTGF在介導DN早期細胞外基質(zhì)（ECM）的聚積晚期腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化中發(fā)揮的重要作用并應(yīng)用己酮可可堿（PTX）干預探討CTGF作為DN治療靶點的研究意義。
　　 萬法:1.體外培養(yǎng)大鼠系膜細胞，研究不同濃度的高糖（15mM和30mM）

3、在不同的刺激時間（24小時、48小時及72小時）對于系膜細胞TGF-β、CTGFmRNA及蛋白質(zhì)的表達、P-Smad2/3、Smad7蛋白質(zhì)表達及纖粘連蛋白（FN）mRNA表達的影響，并在細胞培養(yǎng)液中加入TGF-β中和抗體觀察CTGFmRNA及蛋白質(zhì)的表達、FN表達的變化。2.以鏈脲佐菌素（STZ）誘導糖尿病大鼠為研究對象，應(yīng)用RT-PCR、免疫組化及western-blot等多種分子生物學方法從不同角度研究在糖尿病發(fā)展的不同時期（2w

4、、4w、8w、12w）腎皮質(zhì)中CTGF表達的動態(tài)變化，并研究其與DN早期腎肥大、ECM的聚積及后期腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化之間的關(guān)系，同時以ELISA方法檢測糖尿病大鼠尿液中CTGF含量的變化。3.在高糖培養(yǎng)系膜細胞的培養(yǎng)液中加入不同濃度的PTX（0.1mM、0.3mM、1mM）觀察其對于TGF-β、CTGFmRNA及蛋白質(zhì)表達的影響，進一步體內(nèi)實驗研究PTX干預（50mg/Kg/d）對于糖尿病大鼠腎皮質(zhì)CTGF表達的影響及其對于DN的

5、治療意義。
　　 結(jié)果:1.高糖可以誘導系膜細胞TGF-β、CTGFmRNA及蛋白質(zhì)表達的增加（P<0.05），且呈時間劑量依賴性，同時伴有P-Smad2/3蛋白表達的增加及Smad?蛋白表達的減少，TGF-β的阻斷可以使高糖誘導的CTGFmRNA及蛋白質(zhì)的表達下降86.4％及91.8％（P<0.05）.2.糖尿病大鼠腎皮質(zhì)mRNA及CTGF蛋白質(zhì)的表達2w時開始增加，并隨著病程的發(fā)展逐漸增高，12w時達高峰（P<0.05）；其

6、表達升高早期出現(xiàn)在腎小球內(nèi)而后隨著病程的發(fā)展亦出現(xiàn)于腎小管間質(zhì)區(qū)域。相關(guān)性分析顯示CTGF的表達與TGF-β的表達、腎指數(shù)、腎小球體積、系膜基質(zhì)指數(shù)、腎小管間質(zhì)纖維化程度成正相關(guān)（P<0.05）；糖尿病大鼠尿液中CTGF的含量隨著病程的發(fā)展逐漸升高（P<0.05），與24小時尿μMA、BUN、Cr成正相關(guān)。3.0.3mM的PTX可以使高糖誘導的系膜細胞CTGFmRNA表達下降31.5％，蛋白質(zhì)表達下降18.6％；隨著PTX濃度的進一步增

7、加其抑制CTGF表達的效果更為顯著，1mMPTX分別使CTGFmRNA及蛋白質(zhì)表達下降80.8％及68.9％（P<0.05），但是對于TGF-β的mRNA及蛋白質(zhì)表達均沒有明顯影響（P>0.05）；在糖尿病大鼠模型體內(nèi)實驗中PTX的干預可以使腎臟皮質(zhì)中CTGFmRNA表達及蛋白質(zhì)表達低于同時期DM組，而且這種抑制作用從2W開始一直持續(xù)到12w，在2w、4w、8w、12w可以分別使CTGF蛋白質(zhì)表達下降98.8％、87.8％、72.4％、

8、79.1％（P<0.05），而對于TGF-β而言在2w、4w、8w時PTX并不能使其表達發(fā)生明顯變化（P>0.05），而在12w時PTX組的TGF-β表達要低于同時期DM組（P<0.05）。
　　 結(jié)論:1.高糖主要通過TGF-β-Smads通路使CTGFmRNA表達增加進而影響其蛋白質(zhì)水平表達。2.CTGF在DN發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，CTGF表達的增加貫穿了DN發(fā)病的整個過程，早期介導了腎肥大，腎小球ECM的積聚，晚期