結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在后囊膜混濁中的作用研究.pdf

1、目前白內(nèi)障的主要治療方法是手術(shù)治療，通過(guò)手術(shù)能夠獲得良好的術(shù)后視力。然而后發(fā)性白內(nèi)障（after cataract）（主要表現(xiàn)在后囊膜混濁（posterior capsule opacification,PCO））作為白內(nèi)障術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥會(huì)導(dǎo)致很大一部分患者術(shù)后視力的下降，這樣需要進(jìn)一步的激光手術(shù)治療，但有一定風(fēng)險(xiǎn)。
　　 白內(nèi)障術(shù)后，殘留的晶狀體體上皮細(xì)胞（lens epithelial cells，LECs）轉(zhuǎn)分化為肌成

2、纖維細(xì)胞（myofibroblast），增殖、移行到位于光學(xué)通路上的晶體后囊膜表面，并引起后囊發(fā)生皺縮。轉(zhuǎn)分化的LECs表達(dá)myofibroblast的表型標(biāo)志α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）；大量異常的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular materials,ECM），例如纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、（I型膠原collagen-Ⅰ，CA-Ⅰ）等聚集于轉(zhuǎn)分化細(xì)胞周圍，最終導(dǎo)

3、致PCO的發(fā)生。
　　 CTGF（connective tissue growth factor，CTGF）是一大小為36～38kDa的富含半胱氨酸多肽生長(zhǎng)因子，第一次在人的臍帶內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的下游調(diào)控因子，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞移行、細(xì)胞外基質(zhì)合成、細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化等方面發(fā)揮重要作用。研究表明，CTGF 能夠上調(diào)肺成纖維細(xì)胞以及血管平滑肌細(xì)胞中

4、CA-Ⅰ以及FN的表達(dá)。CTGF的過(guò)量表達(dá)能夠引起肺以及腎的纖維化。同時(shí)，有報(bào)道證實(shí)CTGF 在PCO的發(fā)生中起著一定作用。因此為了進(jìn)一步研究CTGF 在PCO中的作用，我們進(jìn)行了本項(xiàng)試驗(yàn)工作，共分為四部分。
　　 第一部分：CTGF對(duì)體外培養(yǎng)牛眼晶體上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及遷移的作用研究
　　 目的：觀察結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）在體外培養(yǎng)牛眼晶體上皮細(xì)胞（bo

5、vine lens epithelial cells，BLECs）轉(zhuǎn)分化和遷移中發(fā)揮的作用。
　　 方法：將體外培養(yǎng)的第2～3 代牛眼晶體上皮細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組分別經(jīng)0.1×106ng·L-1、0.5×106ng·L-1、1.0×106ng·L-1CTGF處理24h后，采用半定量RT-PCR和Western blotting技術(shù)檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）mRNA以

6、及蛋白表達(dá)的變化。遷移實(shí)驗(yàn)中，利用transwell 小室對(duì)晶體細(xì)胞的移行能力進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)果：與空白對(duì)照組相比，CTGF 能夠明顯促進(jìn)α-SMA mRNA 以及蛋白表達(dá)（P<0.01），并且呈現(xiàn)劑量依賴性。遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CTGF 能夠促進(jìn)晶體上皮細(xì)胞的移行，且差異有顯著意義（P<0.01）。
　　 結(jié)論：CTGF作為T(mén)GF-β的下游調(diào)節(jié)因子，可能在后囊膜混濁（posterior capsuleopacificat

7、ion，PCO）中晶狀體上皮細(xì)胞移行、轉(zhuǎn)分化以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。
　　 第二部分：CTGF SiRNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)牛眼晶體上皮細(xì)胞的研究
　　 目的：觀察結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）干擾RNA（shortinterfering RNA，SiRNA）對(duì)牛眼晶體上皮細(xì)胞（bovine lens epithelial cells，BLECs）

8、的CTGF、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）及纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）表達(dá)的影響。
　　 方法：將體外培養(yǎng)的牛眼晶體上皮細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、刺激組、SiRNA1組、SiRNA2組共5組，各實(shí)驗(yàn)組先經(jīng)50nm·L-1濃度的SiRNA處理后再加入轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1），然后采用實(shí)時(shí)熒光定量

9、PCR（Real-Time PCR）檢測(cè)FN、α-SMA和CTGF mRNA的表達(dá)，同時(shí)采用Western blotting方法分別檢測(cè)相應(yīng)蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：Real-Time PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組FN、α-SMA和CTGF mRNA的表達(dá)與刺激組相比均有不同程度的降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Western blotting結(jié)果顯示，與刺激組相比，SiRNA對(duì)FN、α-SMA和CTGF表達(dá)有明顯的抑制作用，

10、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 結(jié)論：CTGF SiRNA 能夠明顯下調(diào)其目標(biāo)蛋白的表達(dá)，并可以抑制α-SMA和細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)。CTGF作為后囊膜混濁（posterior capsule opacification，PCO）中晶體上皮細(xì)胞移行、轉(zhuǎn)分化以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積的過(guò)程中發(fā)揮一定作用的細(xì)胞因子，可能可以通過(guò)干擾CTGF的表達(dá)來(lái)預(yù)防PCO的發(fā)生。
　　 第三部分：CTGF 在牛眼晶體上皮細(xì)胞中促進(jìn)FN表達(dá)的

11、機(jī)制研究
　　 目的：觀察JNK和PI3K/Akt信號(hào)通路在牛眼晶體上皮細(xì)胞（bovine lens epithelial cells，BLECs）中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）促進(jìn)纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）表達(dá)的作用研究。
　　 方法：取2～3 代細(xì)胞分別加入JNk抑制劑SP-600125、Akt 抑制劑LY-294002、JNKSiRN

12、A和Akt SiRNA，之后加入CTGF（1μg/ml）孵育24h。采用Western blotting 技術(shù)檢測(cè)FN、p-JNK和p-Akt 蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：SP-600125和JNK SiRNA 能夠抑制CTGF誘導(dǎo)FN的表達(dá)（P<0.05）。然而LY-294002和Akt SiRNA對(duì)CTGF誘導(dǎo)FN的表達(dá)沒(méi)有影響（P>0.05）。
　　 結(jié)論：CTGF 在BLECs中誘導(dǎo)FN的表達(dá)是通過(guò)JNk信號(hào)通

13、路介導(dǎo)的，然而Akt信號(hào)通路沒(méi)有影響。這樣對(duì)CTGF誘導(dǎo)后囊膜混濁發(fā)生機(jī)制有了更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。
　　 第四部分：大鼠PCO模型中CTGF和α-SMA表達(dá)的研究
　　 目的：后囊膜混濁（posterior capsule opacification，PCO）作為后發(fā)性白內(nèi)障（aftercataract）的主要表現(xiàn)形式，是白內(nèi)障術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥，其嚴(yán)重影響術(shù)后視力。本部分主要研究大鼠后發(fā)性白內(nèi)障模型形成過(guò)程中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子

14、（connective tissuegrowth factor，CTGF）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達(dá)變化及其關(guān)系。
　　 方法：對(duì)50只Sprague Dawley（SD）大鼠行晶狀體囊外摘除術(shù)（extracapsular lensextraction，ECLE），術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行裂隙燈檢測(cè)，western blot法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)后囊膜CTGF和α-SMA表達(dá)。

15、　　 結(jié)果：通過(guò)光鏡的檢查，在大鼠的PCO模型中可以觀察到典型的PCO病理特征。在PCO的發(fā)展過(guò)程中，CTGF和α-SMA表達(dá)發(fā)生了變化。Α-SMA作為成纖維母細(xì)胞的標(biāo)志，于術(shù)后0 小時(shí)幾乎檢測(cè)不到，3天可檢測(cè)到表達(dá)，7天達(dá)到高峰，14天下降，28天明顯下降。這一變化說(shuō)明了晶體上皮細(xì)胞（lens epithelial cells，LECs）發(fā)生了轉(zhuǎn)分化。CTGF作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor