前列腺癌異常表達microRNAs的篩選及miRNA-182作用機制的初步研究.pdf

1、前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤，前列腺癌的預后與前列腺癌的治療方式有很大關系。雖然包括手術、內分泌治療、放化療和生物治療等傳統(tǒng)的治療手段，對于局限性前列腺癌有很好的療效。但是對于轉移性前列腺癌的治療仍然是一個世界難題。因此，探索前列腺癌浸潤及轉移的分子機制，尋找新的前列腺癌的治療靶點是目前前列腺癌治療研究的重點。miRNAs是一類內生的、長度約19-25個核苷酸的ncRNA，其在細胞內具有多種重要的調節(jié)作用。成熟的microRNA通過

2、與mRNA的3’端UTR部分互補識別引起特定的靶mRNA沉默。隨著miRNA調控基因表達的研究的逐步深入，越來越多的證據(jù)表明，miRNA可以調控那些與發(fā)育、增殖、凋亡及應激反應相關的基因，對細胞自身穩(wěn)定和發(fā)育起著重要作用，而且它們的表達異常是人類惡性腫瘤的一個共同特征。miRNA在包括前列腺癌在內的多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。但是miRNAs在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用的研究近幾年才剛剛起步。并且，隨著大量新的miRN

3、As被發(fā)現(xiàn)，這些新miRNAs在前列腺癌中的表達也需要被及時檢測與分析。
　　第一部分前列腺癌差異表達miRNAs的篩選
　　目的篩選前列腺癌差異表達miRNAs。
　　方法收集了2010年1月至2012年12月期間手術切除的前列腺癌標本5例、良性前列腺增生標本3例。首先運用目前最新版的miRNAs生物芯片技術篩選出前列腺癌的差異表達miRNAs，然后運用RT-PCR方法驗證了芯片結果。最終選出最有可能與前列腺癌增殖、

4、轉移相關的miRNA，作為進一步研究的對象。
　　結果通過miRNAs芯片分析和RT-PCR驗證，我們共發(fā)現(xiàn)前列腺癌中差異表達miRNA27個，其中表達下調的miRNA5個(miR-345，miR-145，miR-221，miR-27b和miR-378)，表達上調的miRNA22個，其中miR-182的表達相比良性前列腺增生組織明顯升高。
　　結論前列腺癌組織中存在著差異表達miRNAs，其中miR-182在前列腺癌組織中的

5、表達明顯升高。因此，下一步將進一步研究miR-182在前列腺癌中的作用。
　　第二部分前列腺癌異常表達miRNAs功能研究
　　目的探討miRNA-182在前列腺癌增殖、凋亡、細胞侵襲方面的作用。
　　方法用RT-PCR方法檢測人正常前列腺上皮細胞系RWPE-1和四種前列腺癌細胞系（PC-3，DU145，22Rv1和LNCaP）中miRNA-182的表達，為了研究此miRNA在前列腺癌中的作用，我們合成了miRNA m

6、imics和miRNAinhibitros，并通過Lipofectamine2000轉染前列腺癌PC-3細胞系，RT-PCR檢測轉染后miRNA-182表達的變化，MTT檢測細胞轉染前后PC-3細胞增殖能力變化;流式細胞術檢測PC-3細胞周期及凋亡的變化;Transwell檢測PC-3細胞侵襲能力的變化。從而探討異常表達的miRNA-182在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　結果我們發(fā)現(xiàn)miRNA-182在這四種前列腺癌細胞系中的

7、表達均高于正常前列腺上皮細胞系RWPE-1，并且PC-3細胞系中miRNA-182表達上調最明顯，因此我們選擇PC-3細胞系用于進一步研究。利用Lipofectamin2000轉染miRNA-182 mimics和miRNA-182 inhibitor及其陰性對照至PC-3細胞系后，RT-PCR檢測結果顯示miRNA-182 mimics和miRNA-182 inhibitor能明顯上調及下調miRNA-182的表達水平，達到進一步研究

8、的要求。MTT實驗檢測PC-3細胞的增殖能力發(fā)現(xiàn)，上調PC-3細胞中的miRNA-182表達，能明顯提高細胞的增殖能力(P＜0.05），相反下調PC-3細胞中miRNA-182表達水平，細胞的增殖能力受到抑制(P＜0.05）;上調PC-3細胞中miRNA-182的表達能夠促進細胞從G0-G1期進入S期，相反下調PC-3細胞中miRNA-182表達，細胞在G0-G1明顯阻滯，并伴隨S期細胞的顯著減少;轉染miRNA-182 mimics后

9、PC-3細胞的凋亡率明顯低于miRNA-182 mimics對照組，相反，轉染miRNA-182 inhibitor后PC-3細胞的凋亡率要顯著高于miRNA-182 inhibitor對照組;將miRNA-182mimics和miRNA-182 inhibitor及其對照轉染入PC-3細胞后，利用Transwell實驗檢測其侵襲能力的變化，結果顯示，轉染miRNA-182 mimics后細胞的侵襲能力明顯高于對照組，而轉染miRNA-

10、182 inhibitor細胞的侵襲能力明顯下降。
　　結論 miR-182在前列腺癌細胞中表達明顯高于正常前列腺上皮細胞，并且前列腺癌PC-3細胞中miR-182表達差異最明顯。miR-182能促使PC-3細胞由G0-G1期進入S期，并通過抑制PC-3細胞的早期凋亡促進細胞的增殖。上調PC-3細胞中miR-182的表達能促進細胞的侵襲。
　　第三部分前列腺癌差異表達miRNAs靶基因研究
　　目的預測miR-182的

11、可能靶基因，并驗證其作用靶點，闡明miR-182的分子作用機制。
　　方法利用生物信息學技術如TargetScan，miRBase和PicTar等優(yōu)秀數(shù)據(jù)庫，預測miRNA可能的靶基因，然后利用Westem blot和熒光素酶雙報告基因檢測驗證預測靶基因的準確性。從而探明miRNA-182在前列腺癌中可能的分子作用機制。
　　結果利用生物信息學技術預測miR-182的可能靶基因為NDRG1。WesternBlot實驗結果顯示

12、轉染miRNA-182 mimics組細胞的NDRG1蛋白含量明顯低于miRNA-182 mimics-NC組，轉染miRNA-182 inhibitor組細胞中NDRG1蛋白含量顯著高于miRNA-182 inhibitor-NC組;我們成功合成了pmirGLO/NDRG2-UTR載體系統(tǒng)，并將pmirGLO/NDRG1-UTR載體與miRNA-182 mimics、miRNA-182 inhibitor共轉染PC-3細胞，結果顯示轉

13、染miRNA-182 mimics上調miRNA-182的表達能明顯抑制pmirGLO/NDRG1-UTR的熒光素酶活性，相反，轉染miRNA-182 inhibitor下調miRNA-182的表達，pmirGLO/NDRG1-UTR的熒光素酶活性增強。
　　結論 miR-182是通過直接與NDRG13'UTR區(qū)結合后下調NDRG1的表達，從而促進前列腺癌PC-3細胞的增殖及侵襲的。miR-182可以作為一種新的前列腺癌基因治療的