生物信息學(xué)方法分析前列腺癌相關(guān)miRNA及MiR-26a在前列腺癌中表達(dá)和作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　前列腺癌(Prostate cancer，PCa)是一種發(fā)病率很高的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。前列腺癌作為男性惡性腫瘤在歐美許多國(guó)家都是最常見的，排在男性因腫瘤死亡的原因的第二位。在我國(guó)，隨著人均壽命的延長(zhǎng)和生活水平的提高，前列腺癌發(fā)病率也在逐年升高。前列腺癌患者臨床惡性程度表現(xiàn)個(gè)體化明顯，大部分的前列腺癌進(jìn)展緩慢，但有相當(dāng)部分前列腺癌的病例迅速進(jìn)展導(dǎo)致疾病惡化。對(duì)于晚期前列腺癌的治療，自1941年Huggins等采用去雄

2、激素療法取得顯著療效后，內(nèi)分泌治療逐漸成為一項(xiàng)重要的方法。在疾病早期這種治療方法多是有效的，此時(shí)前列腺癌稱激素敏感型(androgen-dependent prostate cancer, ADPC)，其有效率一般可達(dá)70％以上。而經(jīng)過大約12～16個(gè)月的病情緩解期后，幾乎所有的ADPC會(huì)進(jìn)展為激素非敏感的前列腺癌(androgen-independent prostate cancer, AIPC)，這時(shí)患者病情急劇惡化，不可遏制，而

3、且腫瘤迅速轉(zhuǎn)移侵襲其它器官，最終導(dǎo)致患者死亡。前列腺癌的診斷可以通過臨床癥狀、體格檢查、前列腺特異性抗原(PSA)檢測(cè)或病理活檢等方法判斷，尤其是PSA的檢測(cè)可以提高前列腺癌的檢出率。但研究顯示由于前列腺癌惡性程度及進(jìn)展過程的個(gè)體差異，目前的診斷和治療水平仍然沒有有效降低前列腺癌的死亡率。因此，研究早期準(zhǔn)確診斷前列腺癌并有效判斷預(yù)后的方法，從而對(duì)于真正惡性程度高并威脅生命的前列腺癌早期診斷和積極治療顯得尤為重要。近來，microRNA(

4、miRNA)表達(dá)譜的分析研究被廣泛用于鑒定腫瘤特異性的miRNA，用來尋找診斷腫瘤的標(biāo)記物，以及用來預(yù)測(cè)疾病的嚴(yán)重程度。所以miRNA也許可以成為達(dá)到這些要求的重要工具。
　　miRNA是小片段、內(nèi)源性表達(dá)的非編碼RNA，在蛋白質(zhì)翻譯水平可以負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達(dá)。它們?cè)诜g水平通過裂解mRNA或抑制靶基因 mRNA的翻譯起始而發(fā)揮作用。研究顯示，miRNA可以控制細(xì)胞生長(zhǎng)的基本過程，如細(xì)胞的分化和發(fā)育周期，這表明的miRNA

5、的變異可以參與多種人類疾病，包括惡性腫瘤。越來越多的證據(jù)表明，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中有miRNA異常表達(dá)的參與。這已經(jīng)在許多腫瘤中被證實(shí)，而且在不同的腫瘤中存在不同類型的miRNA表達(dá)失調(diào)。miRNA對(duì)腫瘤的重要性迅速引起許多研究者的興趣，并獲得大量研究成果，甚至部分miRNA在相應(yīng)腫瘤中的作用的研究成果已經(jīng)申請(qǐng)國(guó)際專利保護(hù)。研究顯示，miRNA可能調(diào)控人類約30％的編碼蛋白基因，人類大部分(52％)miRNA位于已知的腫瘤相關(guān)基因

6、組區(qū)域內(nèi)或已知的基因脆性位點(diǎn)，如果特異性miRNA的表達(dá)改變，可以導(dǎo)致類似腫瘤樣的疾病的發(fā)生和進(jìn)展。miRNA表達(dá)譜的研究獲得越來越多的成果，可能使其迅速成為新的指導(dǎo)臨床的手段，包括:1、研究miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)新的診斷工具。發(fā)現(xiàn)不同性質(zhì)腫瘤的異常表達(dá)的miRNA，用來尋找新的腫瘤標(biāo)記物。2、miRNA表達(dá)譜做為判斷預(yù)后工具。3、發(fā)現(xiàn)miRNA異常表達(dá)與腫瘤的關(guān)系，幫助尋找治療的新靶標(biāo)。
　　目前生物信息學(xué)方法對(duì)基因組計(jì)算分析的方

7、法已被廣泛應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)與預(yù)測(cè)疾病相關(guān)的基因及表達(dá)模式。本研究通過對(duì)前列腺癌的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)庫的差異分析，獲得了前列腺癌相關(guān)的miRNAs。選擇其中相關(guān)性較強(qiáng)的miR-26a，并通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其靶基因，進(jìn)行后期的實(shí)驗(yàn)研究分析其在前列腺癌中的表達(dá)及相關(guān)作用。我們的結(jié)果提示，miR-26a可能在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，miR-26a及其靶基因的異常表達(dá)與前列腺癌細(xì)胞的增殖力、侵襲性、轉(zhuǎn)移能力相關(guān)，可以作為檢測(cè)腫瘤惡性程度

8、的重要標(biāo)志，并且有潛在的靶向治療意義。
　　目的：
　　本研究課題通過對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(GEO)中前列腺癌相關(guān)的基因及miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得前列腺癌相關(guān)的異常miRNA和異常表達(dá)的靶基因mRNA的相互關(guān)聯(lián)配對(duì)。
　　對(duì)生物信息學(xué)篩選獲得的前列腺癌相關(guān)miRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。研究miR-26a在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)特性，探討miR-26a對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其在前列腺癌發(fā)病機(jī)制中所發(fā)揮的重要作用，

9、闡明miR-26a在前列腺癌中發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)理，為深入理解前列腺癌發(fā)病的分子機(jī)制和尋找新的分子靶向治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(GEO)獲得前列腺癌相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對(duì)前列腺癌樣本和正常組織樣本的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析獲得差異表達(dá)mRNA和miRNA。應(yīng)用MiRanda公式及功能富集分析篩選異常miRNA，然后運(yùn)用基因組功能相似性分析(GSFS)方法進(jìn)一步篩選獲得前列腺癌相關(guān)

10、性miRNA。
　　2.應(yīng)用miRNA三種靶基因預(yù)測(cè)工具miRanda、TargetScan、PicTar進(jìn)行所選前列腺癌相關(guān)性較強(qiáng)miR-26a的靶基因預(yù)測(cè)。
　　3.建立前列腺癌細(xì)胞模型，培養(yǎng)RWPE-1細(xì)胞株（人正常前列腺上皮細(xì)胞）及前列腺癌LNCaP、PC3細(xì)胞株。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞中miR-26a表達(dá)情況。鑒定并比較miR-26a在RWPE-1、LNCaP、PC3細(xì)胞模型表

11、達(dá)是否有差異，明確細(xì)胞模型可以用于生物學(xué)功能研究。
　　4.以miR-26a mimic及anti-miR26a瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LNCaP、PC3細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞中miR-26a表達(dá)情況，確定轉(zhuǎn)染效果。
　　5.CCK-8方法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后LNCaP、PC3細(xì)胞的增殖能力及細(xì)胞周期變化。
　　6.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后LNCaP、PC3細(xì)胞的侵襲能力變化。
　　7.qRT-P

12、CR方法檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞中miR-26a靶基因EZH2表達(dá)，明確其在轉(zhuǎn)染前后表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.應(yīng)用前列腺癌相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，對(duì)前列腺癌樣本和正常組織樣本的RNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析獲得差異表達(dá)的2160個(gè)mRNA和71個(gè)miRNA。應(yīng)用MiRanda公式及功能富集分析篩選獲得異常miRNA28個(gè)，然后運(yùn)用GSFS方法篩選獲得前列腺癌相關(guān)性miRNA，相關(guān)性較強(qiáng)的有miR-26amiR-152/7、miR

13、-19a、miR-30c、miR-19b和miR-146b-5p。
　　2.應(yīng)用miRNA三種靶基因預(yù)測(cè)工具進(jìn)行miR-26a的靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示3種方法均預(yù)測(cè)Enhancer of Zeste Homolog2(EZH2)為miR-26a的相關(guān)性較強(qiáng)的靶基因，且得分較高，結(jié)果可靠。
　　3.qRT-PCR方法檢測(cè)RWPE-1、LNCaP、PC3細(xì)胞中miR-26a表達(dá)情況，結(jié)果顯示兩種前列腺癌細(xì)胞LNCaP、PC3細(xì)胞中

14、miR-26a表達(dá)均低于正常前列腺細(xì)胞RWPE-1， PC3細(xì)胞中miR-26a表達(dá)明顯低于LNCaP細(xì)胞。表明miR-26a在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，為進(jìn)一步研究其在前列腺癌中的生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。
　　4.成功的轉(zhuǎn)染miR-26amimic及anti-miR26a至前列腺癌LNCaP、PC3細(xì)胞，qRT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-26amimic后，LNCaP、PC3細(xì)胞表達(dá)miR-26a分別升高3.78倍和4.69倍(P＜0

15、.01);而轉(zhuǎn)染anti-miR26a后，LNCaP、PC3細(xì)胞表達(dá)miR-26a分別降低83％和61％。結(jié)果顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-26a mimic及anti-miR26a可有效上調(diào)或下調(diào)miR-26a表達(dá)。
　　5.CCK-8方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染了miR-26a的LNCaP及PC3細(xì)胞增殖能力改變，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-26a mimic96小時(shí)后LNCaP及PC3細(xì)胞增殖率均下降，但后者下降明顯(P＜0.01)，進(jìn)一步行流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示P

16、C3細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)顯著增多，S期細(xì)胞數(shù)減少。證明miR-26a有可能抑制前列腺癌細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)。
　　6.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-26a mimic的兩種前列腺癌細(xì)胞侵襲能力明顯下降，其中以PC3下降明顯。
　　7.通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-26a mimic及anti-miR26a至LNCaP、PC3細(xì)胞，qRT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示miR-26a過表達(dá)顯著抑制EZH2的mRNA和蛋白的表達(dá)，而轉(zhuǎn)

17、染anti miR-26a可顯著上調(diào)EZH2 mRNA和蛋白的表達(dá)。表明在前列腺癌細(xì)胞中EZH2為miR-26a的靶基因，miR-26a可以通過調(diào)控靶基因EZH2的表達(dá)發(fā)揮其生物學(xué)作用。
　　結(jié)論：
　　1.生物信息學(xué)方法對(duì)腫瘤的基因組的分析為發(fā)現(xiàn)目標(biāo)mRNAs和miRNAs提供了一個(gè)有利工具，可以在巨大的基因信息中快速尋找可能的研究切入點(diǎn)，可以為進(jìn)一步生物學(xué)研究證實(shí)奠定基礎(chǔ)。
　　2.同樣miRNA的靶基因預(yù)測(cè)工具可

18、以有效的對(duì)其作用目標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)，對(duì)miRNA功能表達(dá)的研究有非常重要作用。
　　3.miR-26a在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，可能在前列腺癌的發(fā)生過程發(fā)揮作用。侵襲性更強(qiáng)的激素非敏感型前列腺癌細(xì)胞PC3中miR-26a的表達(dá)水平明顯低于激素敏感型前列腺癌細(xì)胞LNCaP，提示miR-26a表達(dá)失調(diào)可能在前列腺癌的雄激素非依賴轉(zhuǎn)化等前列腺癌的發(fā)展、惡化過程中發(fā)揮了重要的作用。
　　4.在前列腺癌中EZH2是miR-26a的靶基因，