基于microRNA技術(shù)抑制成熟樹突狀細胞對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的抗原呈遞.pdf

1、對于遺傳疾病的基因治療,能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)基因的長期穩(wěn)定表達、而不引起宿主免疫反應的轉(zhuǎn)基因表達系統(tǒng),是醫(yī)療界孜孜以求的目標。自1990年起,已有1996項基因治療項目進入臨床研究,在先天性黑內(nèi)障、血友病等疾病的基因治療中已取得重大突破。但由于基因治療的臨床研究中出現(xiàn)了不同程度的免疫反應,特別是細胞免疫毒性,基因治療在臨床研究中的廣泛應用受到了限制。
　　基因治療藥物引起細胞免疫毒性的具體原因尚無定論,目前還沒有適當?shù)膽獙Σ呗??；跇渫粻罴?/p>

2、胞(DC)是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞(APC),本研究認為 DC可能是引起基因治療細胞免疫毒性的執(zhí)行者。未成熟樹突狀細胞(iDC)具有極強的抗原攝取能力,一旦有抗原進入,立即被iDC攝取,iDC被激活并向遷移淋巴結(jié)遷移,遷移過程中即分化為成熟樹突狀細胞(mDC), mDC能夠刺激T細胞分化為特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL),產(chǎn)生細胞免疫毒性。因此,本課題提出,特異性地減少 mDC內(nèi)轉(zhuǎn)基因的表達,從而降低mDC對抗原的呈遞,但又不

3、影響轉(zhuǎn)基因在其它正常細胞內(nèi)的表達,可能是規(guī)避基因治療藥物因轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物所誘導的細胞免疫毒性的有效方法。
　　MicroRNA(miRNA)是一類具有靶基因調(diào)控功能的非編碼小 RNA,在進化過程中高度保守,能與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)進行特異性地堿基互補配對,促進其剪切、降解或抑制翻譯,從而調(diào)控靶基因的表達。mDC特異性高表達miR155的特性,為我們構(gòu)建可以特異性沉默mDC內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達載體提供了條件。本課題將與mi

4、R155完全互補的結(jié)合序列(miR155T)串聯(lián)插入到載體表達框的3’UTR中,構(gòu)建了新型基因治療載體,并利用非病毒載體及慢病毒載體驗證了我們的學術(shù)假設。
　　本研究首先通過新型基因治療載體與miR155 mimic的共轉(zhuǎn)染實驗,驗證了miR155可以有效抑制新型基因治療載體的轉(zhuǎn)基因表達。DC從非成熟到成熟的轉(zhuǎn)化過程中,內(nèi)源性miR155表達逐漸上升,在轉(zhuǎn)染新型重組載體后,轉(zhuǎn)基因表達也逐漸降低,符合本研究預期。隨后,我們以細胞免疫

5、實驗常用的強抗原蛋白卵白蛋白(OVA)為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物,構(gòu)建了含miR155T的新型重組慢病毒載體。經(jīng)流式細胞術(shù)檢測,在轉(zhuǎn)導不同成熟度的DC后,轉(zhuǎn)基因抗原OVA的抗原肽在mDC表面的呈遞能夠被有效抑制。不同成熟度的DC轉(zhuǎn)導含miR155T的新型重組慢病毒載體轉(zhuǎn)導后,與EdU標記的T細胞共培養(yǎng),可明顯降低對T細胞的激活能力。
　　總之,miR155在mDC內(nèi)的特異性高表達,可以有效抑制含miR155T的新型基因治療載體在mDC內(nèi)的轉(zhuǎn)基因