miR-375過表達對心肌樣細胞增殖、凋亡和分化的影響.pdf

1、心臟是胚胎發(fā)育過程中最早形成的器官，其間涉及許多相關(guān)基因依時空順序差次表達以及多條信號通路（如Notch信號通路、BMP信號通路、Wnt信號通路等）的精確調(diào)控，以保證心肌細胞的正確遷移、增殖以及分化。其中，任意基因的異常都有可能導致先天性心臟病的發(fā)生。先天性心臟病是新生兒期最常見的先天畸形之一，發(fā)病率高達0.8％～1％，是導致人類孕期流產(chǎn)、死胎和新生兒發(fā)育缺陷甚至死亡的主要原因之一，嚴重危害著人類的健康和生存質(zhì)量，給家庭和社會帶來巨大的

2、負擔。因此，從基因和分子水平探索胚胎心臟形成及發(fā)育機制成為防治先天性心臟病基礎(chǔ)研究新方向之一。
　　MicroRNA(miRNA)是一類長約22 nt的非編碼小RNA，通過與靶基因mRNA的3'UTR區(qū)域結(jié)合，介導mRNA降解或抑制其轉(zhuǎn)錄后水平的表達，導致靶標蛋白表達降低，從而參與并調(diào)控時序發(fā)育、細胞凋亡、細胞分化、激素分泌等生理過程及多種疾病發(fā)生過程，其表達水平的變化與疾病的發(fā)生密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs無論是在細胞增殖、分

3、化，還是在生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮重要作用，因而引起了研究人員越來越多的關(guān)注。有關(guān)研究表明，miRNA不僅參與了心臟發(fā)育與心肌重構(gòu)，并且在心臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起著一定作用。
　　本研究小組前期通過生物芯片技術(shù)篩選發(fā)現(xiàn)，miR-375基因在室間隔缺損胚胎心肌組織中的表達豐度顯著高于正常人工流產(chǎn)胚胎心肌組織，隨后我們采用實時熒光定量PCR驗證了這一結(jié)果;另外我們還發(fā)現(xiàn)miR-375在先天性心臟病胎兒的孕母（妊娠18-22周）

4、血液中也呈現(xiàn)高表達，提示miR-375很有可能在胚胎心臟發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。但miR-375致胚胎心臟發(fā)育畸形的功能與機制研究目前并無文獻報道。鑒于P19細胞和斑馬魚是心臟發(fā)育分子機制研究的經(jīng)典模型，本研究借助上述模型，通過改變miR-375表達水平，探討了miR-375過表達對P19細胞增殖、凋亡、分化的影響，評價了其在斑馬魚胚胎心臟發(fā)育中的功能，并初步分析了miR-375下游作用的靶標，為先天性心臟病發(fā)病機制的基礎(chǔ)研究提供新線

5、索。
　　第一部分miR-375過表達對P19細胞增殖、凋亡的影響
　　目的:構(gòu)建miR-375過表達質(zhì)粒，篩選出穩(wěn)定過表達miR-375的P19細胞株，研究miR-375對P19細胞增殖、凋亡的影響;獲得miR-375過表達影響斑馬魚胚胎心臟發(fā)育的表型。
　　方法:構(gòu)建miR-375過表達質(zhì)粒，與GFP（green fluorescent protein，綠色熒光蛋白）對照載體分別轉(zhuǎn)染P19細胞，嘌呤霉素篩選兩周，熒

6、光觀察和qRT-PCR驗證篩選出穩(wěn)定表達miR-375的細胞株。CCK-8檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期;并用Hoechst染色、流式細胞計數(shù)分析、實時熒光定量PCR等技術(shù)，檢測Bax/Bcl-2表達水平;Westem blot法檢測凋亡過程中蛋白水平的變化，以評價miR-375對P19細胞凋亡的影響;斑馬魚單細胞期顯微注射miR-375 minics觀察miR-375對胚胎心臟形態(tài)學的影響。
　　結(jié)果:miR-375過表達

7、抑制了P19細胞的增殖;抑制P19細胞進入S期，凋亡相關(guān)的Bax/Bcl-2比值增高，細胞凋亡增加;miR-375過表達可致斑馬魚胚胎發(fā)育出現(xiàn)心包水腫等心臟畸形表型。
　　結(jié)論:miR-375過表達能夠影響P19細胞的增殖與凋亡功能，并致斑馬魚胚胎發(fā)育出現(xiàn)心包水腫等心臟畸形表型。
　　第二部分miR-375過表達對P19細胞分化和Notch信號通路的影響
　　目的:研究miR-375過表達對P19細胞分化、Notch信

8、號通路的影響。
　　方法:誘導穩(wěn)定過表達miR-375的P19細胞向心肌細胞分化，實時熒光定量PCR檢測心肌細胞分化過程中心肌特異性標記物GATA4、cTnT、Mef2c的變化以及Notch信號通路相關(guān)因子在分化過程中的表達變化，Westem blot法檢測分化過程中相關(guān)蛋白表達的變化。熒光素酶驗證Notch2是否是miR-375的下游靶標。
　　結(jié)果:miR-375過表達可抑制P19細胞向心肌細胞的分化，心肌標記物的表達量