MiR-375與人胚胎干細(xì)胞定向分化為胰島素分泌細(xì)胞的相關(guān)性研究.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞（hESCs）是一種多潛能干細(xì)胞，具有在體外無限增殖、自我更新和向機(jī)體各種類型細(xì)胞分化的能力。hESCs在特定條件下可分化為胰島素分泌細(xì)胞(IPCs)，可以用于移植治療Ⅰ型糖尿病，以解決臨床治療器官來源不足的問題。MiR-375是胰腺發(fā)育和成熟過程中必不可少的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在胰島β細(xì)胞和非β細(xì)胞中均有表達(dá)，能夠提高胰島素轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖。因此，研究miR-375在hESCs向IPCs分化過程中的作用，對于提高h(yuǎn)E

2、SCs向IPCs分化的效率，獲得單一表達(dá)Insulin的成熟胰島β細(xì)胞具有重要意義。本研究在特定條件下使hESCs向IPCs分化，分化過程包括終末內(nèi)胚層(StageⅠ)、原腸(StageⅡ)、內(nèi)分泌前體(StageⅢ)和胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞(StageⅣ)四個階段。先以分化體系中的維甲酸(RA)為變量優(yōu)化分化條件，再分別采用慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定過表達(dá)和脂質(zhì)體介導(dǎo)的瞬時過表達(dá)提高細(xì)胞miR-375的表達(dá)水平，通過實時定量PCR檢測miR-375和分

3、化各階段標(biāo)志性基因Foxa2、Cxcr4、Ngn3、Pdx1、Insulin、Glucagon、Somatostatin的相對表達(dá)量，并通過免疫熒光染色和Elisa檢測胰島素合成和分泌情況，從而研究過表達(dá)miR-375對hESCs分化為IPCs的影響。
　　1、為了優(yōu)化hESCs分化為IPCs的培養(yǎng)條件，在終末內(nèi)胚層向內(nèi)分泌前體細(xì)胞分化的不同時間段添加2μM RA對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，分別為不添加RA、在StageⅡ添加RA、在Stag

4、eⅢ添加RA、在StageⅡ和StageⅢ都添加RA。研究發(fā)現(xiàn)在沒有RA誘導(dǎo)的條件下，hESCs未能成功分化為IPCs;在StageⅡ添加RA的條件下，胰向分化相關(guān)基因Foxa2、Cxcr4、Ngn3、Pdx1、Insulin、Glucagon和Somatostatin的相對表達(dá)量最高，并且在此條件下細(xì)胞一直保持良好的生長狀態(tài)。因此在細(xì)胞分化StageⅡ添加2μMRA可作為分化培養(yǎng)的最佳條件。
　　2、通過對hESCs進(jìn)行慢病毒介

5、導(dǎo)的miR-375穩(wěn)定過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)慢病毒感染會對hESCs的生長狀態(tài)造成極大影響，降低細(xì)胞增殖分化能力并增加細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞在分化早期大量死亡，進(jìn)而導(dǎo)致hESCs無法分化產(chǎn)生IPCs。
　　3、對分化不同時期的hESCs進(jìn)行脂質(zhì)體介導(dǎo)的miR-375 mimic轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)在分化早期過表達(dá)miR-375會提高Foxa2和Cxcr4的相對表達(dá)量，在分化中期過表達(dá)miR-375會提高Ngn3和Pdx1的相對表達(dá)量，在分化末期過表達(dá)miR