17-AAG和YM155單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株Te-1的影響.pdf

1、背景:熱休克蛋白90(heatshockprotein90，HSP90)普遍存在于真核和原核細(xì)胞中，是一組高度保守的分子伴侶。研究證實(shí)，在多數(shù)惡性腫瘤組織中HSP90呈高表達(dá)狀態(tài)，在正常組織表達(dá)很低，目前HSP90已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，其抑制劑也成為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。17-AAG是目前研究最多的HSP90抑制劑，已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。17-AAG可競(jìng)爭(zhēng)HSP90ATP結(jié)合位點(diǎn)，HSP90內(nèi)源性ATP酶活性被抑制，導(dǎo)致HSP90作用的底物

2、蛋白不能與其結(jié)合而失去穩(wěn)定性，從而被蛋白酶水解。在體內(nèi)外抗腫瘤活性上17-AAG顯示出很好的效果，因而被廣泛關(guān)注。但關(guān)于17-AAG作用于食管鱗癌細(xì)胞的研究報(bào)道不多。
　　 HSP90底物蛋白眾多，其中很多是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白，在腫瘤的發(fā)生和演進(jìn)中起重要作用。在HSP90眾多的底物蛋白中，survivin是重要的一員。它是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein，IAP)家族的新成員，是目前發(fā)

3、現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白，在人的胚胎組織和幾乎所有人類(lèi)常見(jiàn)惡性腫瘤組織中高表達(dá)，而在健康成人組織和終末分化組織表達(dá)水平很低，提示其與腫瘤的形成密切相關(guān)。近年來(lái)survivin也成為人們關(guān)注的抗腫瘤靶點(diǎn)。研究表明通過(guò)抑制其表達(dá)可有效地破壞腫瘤細(xì)胞的生存、發(fā)展，誘導(dǎo)其凋亡并降解。YM155是目前研究最成功的survivin的小分子拮抗劑，已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段。YM155通過(guò)抑制survivin基因啟動(dòng)子活性，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力。目前Y

4、M155已在非小細(xì)胞肺癌、黑素瘤等腫瘤臨床試驗(yàn)中取得一定效果，但對(duì)食管鱗癌細(xì)胞作用的相關(guān)報(bào)道很少。
　　 目的:本研究通過(guò)觀察17-AAG和YM155單獨(dú)及聯(lián)合作用于食管鱗癌細(xì)胞株TE-1，旨在探討兩種不同用藥方法在體外對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及HSP90和survivin在蛋白水平上的變化并分析其可能作用機(jī)制，為17-AAG、YM155在食管鱗癌治療中單獨(dú)及聯(lián)合臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.細(xì)

5、胞培養(yǎng)
　　 用于實(shí)驗(yàn)的食管鱗癌細(xì)胞株TE-1由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供，細(xì)胞以含10％胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基置于37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。
　　 2.MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性
　　 分別以不同濃度的17-AAG、YM155單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用分別處理TE-1細(xì)胞，以不含藥物的TE-1細(xì)胞為對(duì)照組，作用細(xì)胞24h、48h、72h后，檢測(cè)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率。
　　 3

6、.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率
　　 流式細(xì)胞術(shù)PI單染的流式細(xì)胞學(xué)方法定量分析對(duì)照組和經(jīng)不同濃度的17-AAG、YM155單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用分別處理TE-1細(xì)胞48h后的凋亡率。
　　 4.蛋白免疫印跡(Westernblot)檢測(cè)HSP90和survivin蛋白表達(dá)水平
　　 對(duì)照組和不同濃度的17-AAG、YM155單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用分別處理TE-1細(xì)胞后48h后，提取細(xì)胞總蛋白，采用westernblot方

7、法，檢測(cè)其HSP90和survivin蛋白的表達(dá)水平。
　　 5.統(tǒng)計(jì)
　　 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)用(x)±s表示，對(duì)照組和單獨(dú)用藥組各組間均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析，聯(lián)合用藥組與單獨(dú)用藥組各組間均數(shù)比較應(yīng)用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT結(jié)果顯示:
　　 17-AAG、YM155(以終濃度0.02μM、0.2μM、2μM、20

8、μM和40μM的17-AAG和終濃度0.01nM、0.1nM、1nM、10nM和100nM的YM155)單獨(dú)作用于TE-1細(xì)胞24h、48h和72h后，隨著藥物濃度的增加分別在24h、48h、72h抑制率逐漸增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(Fig.1、2;Table1)，且呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。
　　 17-AAG、YM155(以終濃度0.2μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155，終濃度2μM17

9、-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155，終濃度20μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155)聯(lián)合作用于TE-1細(xì)胞24h、48h和72h后，比單獨(dú)用藥組對(duì)TE-1細(xì)胞的抑制率明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(Fig.3-5、Table1、Table2-4)，提示兩者聯(lián)合用藥抑制增殖作用強(qiáng)于單獨(dú)用藥。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:
　　 單獨(dú)應(yīng)用17-AAG和YM155

10、(以終濃度0.2μM、2μM和20μM的17-AAG和終濃度0.1nM、1nM和10nM的YM155)作用于TE-1細(xì)胞48h后，隨著藥物濃度的增加其凋亡率逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(Fig.6、7;Table5)，且呈劑量依賴(lài)性。
　　 聯(lián)合應(yīng)用17-AAG和YM155(以終濃度0.2μM17-AAG和終濃0.1nM、1nM、10nM的YM155，終濃度2μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的Y

11、M155，終濃度20μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155)作用于TE-1細(xì)胞48h后，聯(lián)合用藥組分別比單獨(dú)用藥組對(duì)TE-1細(xì)胞凋亡率明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(Fig.6-8;Table6)。提示聯(lián)合用藥促凋亡作用強(qiáng)于單獨(dú)用藥。
　　 3.Westernblot結(jié)果顯示:
　　 不同濃度的17-AAG和YM155單獨(dú)作用于TE-1細(xì)胞48h后，結(jié)果顯示:兩種藥物各個(gè)濃度組之間的

12、HSP90/GADPH灰度比值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(Fig.9、10、12、13;Table7)。分別以終濃度0.2μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155，終濃度2μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155，終濃度20μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155聯(lián)合作用TE-1細(xì)胞，結(jié)果顯示各聯(lián)合用藥組與單獨(dú)用藥組之間的HSP90/GADPH灰度比值差異均

13、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(Fig.11、Fig.14-22;Table8)。
　　 不同濃度的17-AAG和YM155單獨(dú)作用于TE-1細(xì)胞48h后，結(jié)果顯示兩種藥物各濃度組之間的Survivin/GADPH灰度比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P＜0.05)(Fig.9、10、12、13;Table7)，且隨著藥物濃度的增加，灰度比值逐漸降低，呈劑量依賴(lài)性。分別以終濃度0.2μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM15

14、5，終濃度2μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155，終濃度20μM17-AAG和終濃度0.1nM、1nM、10nM的YM155聯(lián)合作用TE-1細(xì)胞，結(jié)果顯示各聯(lián)合用藥組與相應(yīng)單獨(dú)用藥組之間Survivin/GADPH灰度比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(Fig.11、Fig.14-22;Table9)。聯(lián)合用藥組的灰度比值明顯低于單獨(dú)用藥組，提示聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥更能下調(diào)survivin蛋白表達(dá)。
　

15、　 結(jié)論:
　　 1.17-AAG、YM155均能有效抑制TE-1細(xì)胞的增殖活性，且二者對(duì)TE-1細(xì)胞的增殖活性抑制作用均呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。
　　 2.17-AAG、YM155聯(lián)合應(yīng)用比較單獨(dú)應(yīng)用，對(duì)TE-1細(xì)胞增殖活性有更強(qiáng)的抑制作用。
　　 3.17-AAG、YM155均能促進(jìn)TE-1細(xì)胞的凋亡，且二者對(duì)TE-1細(xì)胞的促凋亡作用均呈劑量依賴(lài)性。
　　 4.17-AAG聯(lián)合YM155對(duì)TE-1細(xì)胞有