下調(diào)HMGB1表達對食管鱗狀細胞癌TE-1細胞放療敏感性的影響和機制研究.pdf

1、【目的】探討HMGB1表達對食管鱗狀細胞癌TE-1細胞放療敏感性的影響，并初步探討其分子調(diào)控機制。
　　【方法】
　?。?）應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，通過Lipofectamine2000分別將空載體陰性對照（NC siRNA）和HMGB1干擾載體（siHMGB1）轉(zhuǎn)染至人食管鱗狀細胞癌細胞株TE-1，按不同分組標(biāo)記為：TE-1組（空白對照組），TE-1+NC siRNA組（空載體陰性對照組），TE-1+siHMGB1組（HM

2、GB1沉默組）；通過實時定量PCR法檢測各組TE-1細胞內(nèi)HMGB1 mRNA的表達變化，Western blot法進一步驗證轉(zhuǎn)染TE-1細胞內(nèi)HMGB1蛋白的表達改變；
　?。?）對上述三組TE-1細胞在轉(zhuǎn)染后進行不同劑量（0、2、4、6、8 Gy）X射線照射培養(yǎng)一定的時間（24、48、72、96小時），通過MTT法檢測TE-1細胞的增殖率；
　　（3）對上述三組TE-1細胞在轉(zhuǎn)染后進行上述不同劑量X射線照射后培養(yǎng)15天，

3、通過克隆形成實驗檢測TE-1細胞的克隆形成率；
　?。?）上述轉(zhuǎn)染處理24小時，給予4 Gy X射線照射后，流式細胞術(shù)檢測各組TE-1細胞的凋亡率、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）含量和γH2AX水平；用實時定量PCR法檢測各組TE-1細胞NOX1與NOX5 mRNA的表達變化；Western blot法檢測各組TE-1細胞Caspase-3、Cleaved PARP、p38、p-p38、JNK、

4、p-JNK蛋白的表達變化。
　　【結(jié)果】
　　（1）HMGB1沉默組TE-1細胞中HMGB1 mRNA和蛋白的表達量均較空白對照組、空載體陰性對照組顯著降低（均P<0.001）；
　?。?）MTT法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后24、48、72、96小時HMGB1沉默組TE-1細胞增殖率低于空白對照組及空載體陰性對照組（均P<0.05）；轉(zhuǎn)染后24小時行4 Gy X射線照射24、48、72、96小時后，轉(zhuǎn)染前后三組TE-1細胞的增

5、殖能力均受到抑制，而HMGB1沉默組TE-1細胞增殖抑制程度較其他兩組明顯（均P<0.05）；轉(zhuǎn)染后24小時經(jīng)不同劑量（0、2、4、6、8 Gy）的X射線照射48小時后：隨著X射線照射劑量的增加，三組TE-1細胞的增殖率均降低， HMGB1沉默組細胞增殖抑制較兩對照組明顯（均P<0.05）；
　?。?）Sigmaplot軟件分析結(jié)果顯示HMGB1沉默組D0、Dq、N值均低于空白對照組和空載體陰性對照組；HMGB1沉默組相對于空白對

6、照組的放射增敏比（ sensitizingenhancement ratio，SER）為1.26；
　　（4）流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后24小時，HMGB1沉默組凋亡率、ROS含量和γH2AX水平高于兩對照組；實時定量PCR檢測結(jié)果顯示HMGB1沉默組NOX1和NOX5 mRNA的表達高于兩對照組；Western blot檢測結(jié)果顯示HMGB1沉默組Caspase-3、Cleaved PARP、p-p38、p-JNK蛋白的表達

7、高于兩對照組（均P<0.05）；轉(zhuǎn)染后24小時起給予4 Gy X射線照射，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示HMGB1沉默組凋亡率、ROS含量和γH2AX水平高于單純放療組；實時定量PCR檢測結(jié)果顯示HMGB1沉默組NOX1與NOX5 mRNA的表達高于單純放療組；Western blot檢測結(jié)果顯示 HMGB1沉默組Caspase-3、Cleaved PARP、p-p38、p-JNK蛋白的表達高于單純放療組（均P<0.05）。
　　【結(jié)論】

8、
　　通過體外細胞實驗研究，發(fā)現(xiàn)下調(diào)HMGB1表達能抑制人食管鱗狀細胞癌細胞株TE-1放療后的增殖率，降低其克隆形成能力，即下調(diào)HMGB1表達能提高TE-1細胞對放療的敏感性。其分子機制是下調(diào) HMGB1表達可能通過上調(diào)促細胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3/Cleaved PARP的表達以及上調(diào)ROS產(chǎn)生來影響DNA損傷，并通過JNK和p38通路激活，上調(diào)p-p38和p-JNK蛋白表達，調(diào)控放療對TE-1細胞增殖和凋亡能力改變，進