周期性應力加載對C2C12細胞自身抗原及TLR3表達的影響.pdf

1、特發(fā)性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathies，IIMs)是一組異質性的骨骼肌自身免疫性疾病，臨床上以進行性肌無力伴骨骼肌炎癥細胞浸潤為特征。根據(jù)不同的臨床及組織病理形態(tài)學特征，炎性肌病可分為多發(fā)性肌炎(polymyositis，PM)、皮肌炎(dermatomyositis，DM)和包涵體肌炎(inclusion-body myositis，IBM)[1]。廣泛出現(xiàn)的毛細血管周圍(DM)、肌束膜和

2、肌內膜(PM，IBM)的多種炎性細胞浸潤是炎性肌病的特征性病理改變。肌組織內滲出的巨噬細胞，單核細胞，中性粒細胞等釋放多種化學因子和趨化因子，或協(xié)同炎性肌纖維（表達MHC-Ⅰ）發(fā)揮抗原呈遞(APCs)作用，動員炎性肌組織內T細胞的滲出和/或原位克隆，通過釋放穿孔素、顆粒酶等細胞毒性因子，殺傷與之接觸的、或遠距離的肌纖維，引發(fā)持續(xù)而反復的肌纖維壞死和無效的成肌再生[2-4]。自身免疫性肌炎患者的臨床特征性表現(xiàn)為進行性加重的肌無力、肌纖維化

3、和肌萎縮（以近端肌肉更為嚴重）?；颊咦罱K因肌纖維的喪失和肌組織的纖維化，出現(xiàn)骨骼肌收縮能力的完全喪失。磁共振波譜檢測證實，由于毛細血管減少，肌細胞線粒體功能障礙，炎性肌細胞出現(xiàn)三磷酸腺苷(ATP)和磷酸肌酸(PCr)含量下降，導致肌纖維能量代謝障礙、肌無力持續(xù)加重，以及成肌再生不良[5]。目前治療IIMs主要以皮質類固醇聯(lián)合免疫抑制劑為主，雖然部分患者經藥物治療后肌肉性能得到改善，但僅能恢復肌肉部分功能[6];多數(shù)患者經長療程治療后仍殘

4、留功能受限和生活質量低下，而長期高劑量使用皮質類固醇和免疫抑制劑會導致慢性骨和肌肉代謝損傷[7]。
　　 近年的研究證實，運動和拉伸訓練能改善IIMs患者肌肉收縮強度，減少肌肉損傷，改善肌肉性能[8-10]。此外，力學刺激是維持細胞生存和生長的重要細胞外刺激，調節(jié)細胞的新陳代謝和基因表達過程，在成肌細胞激活、增殖與分化中起著重要作用[11]。國內外已有大量研究證實力學刺激能促進成肌細胞增殖，肝細胞生長因子(HGF)已被證實是唯一

5、一種能激活體內或體外培養(yǎng)的靜止期成肌細胞進入細胞周期的生長因子[12]。通過檢測DNA摻合溴脫氧尿核苷的方式，Tatsumi R[13]的研究組發(fā)現(xiàn):力學刺激體外培養(yǎng)的成肌細胞2小時，可導致HGF活化;進一步的研究發(fā)現(xiàn)力學刺激促進一氧化氮合成酶(NOS)激活，誘導HGF釋放，導致成肌細胞活化增殖[14]。Tatsumi R因此總結出力學刺激導致成肌細胞增殖的力學信號通道:Calcium-Calmodulin復合物形成、NOS和金屬蛋白酶

6、(MMPs)激活、HGF釋放并結合C-met受體，從而促進成肌細胞增殖[15]。
　　 生理條件下，骨骼肌組織表達極微量的肌炎自身抗原，而炎性肌組織中反復再生的不成熟肌纖維則持續(xù)高表達特異性的肌炎自身抗原，如histidyl tRNAsynthetase(HRS/Jo-1)，Mi-2(DM患者)，U1-70，以及Ku/the catalyticsubunit of DNA-dependent protein kinase(DNA

7、-PKcs)，體外培養(yǎng)的成肌細胞表達高水平的自身抗原，但隨著成肌細胞分化融合并形成肌管，自身抗原逐漸下調，這表明在自身免疫性肌病的發(fā)生發(fā)展過程中，自身抗原主要由再生的肌纖維合成和表達，炎性過程的啟動和發(fā)展并不涉及成熟的肌管[16，17]。炎性肌病的發(fā)展過程中，表達自身抗原的再生肌纖維成為細胞毒性攻擊的目標，反復發(fā)生的肌纖維壞死和成肌再生分化導致自身抗原的持續(xù)產生，從而引發(fā)肌炎的病理過程和免疫反應的持續(xù)性和不可修復性。此外，作為Ⅰ型跨膜蛋

8、白，Toll樣受體家族(Toll-like receptors，TLRs)成員在先天性免疫反應，尤其是調節(jié)吞噬細胞（如巨噬細胞等）特異性識別微生物病原體抗原，分泌促炎細胞因子，上調共刺激分子并誘導機體獲得性免疫反應過程中發(fā)揮重要調控作用，被稱為先天性和獲得性免疫調節(jié)中的輔助受體.近期的研究(Tournadre A，2010)[18]發(fā)現(xiàn)，自身免疫性肌炎患者的骨骼肌組織呈現(xiàn)TLR3和TLR7的陽性表達，尤其高表達于成肌細胞，并經由TLR信

9、號通路，促使Th1和Th17相關細胞因子分泌釋放，加速肌纖維的壞死和收縮功能的喪失。
　　 炎性肌病以肌組織的壞死、肌萎縮和收縮力減弱或喪失為特征，那么，肌炎自身抗原、TLRs在增殖的成肌細胞內呈現(xiàn)高表達的特性與成肌細胞的力學信號之間是否存在相關性，力學信號是否直接指導并參與肌炎自身抗原的啟動以及Toll受體的表達？力學信號的減弱或消失是否促進或降低自身抗原和Toll受體的表達，從而加速肌纖維的壞死并影響炎性肌病的發(fā)生和歸宿？本

10、實驗對體外培養(yǎng)的C2C12細胞進行周期性的促增殖應力加載刺激，檢測力學加載前后成肌細胞自身抗原和TLRs的表達，判斷力學信號是否促進或抑制成肌細胞自身抗原和TLRs的表達和釋放。在此基礎上，采用不同的拮抗劑或促進劑干擾成肌增殖特定的力學信號分子，進一步分析成肌細胞內特定力學增殖信號分子（Calcium，Calmodulin，NOS，MMPs，HGF，C-met）對自身抗原和TLRs表達可能的干擾作用，從而揭示骨骼肌收縮能力與肌炎自身抗原

11、、TLRs的相關性。
　　 主要研究內容
　　 第一章篩選促進C2C12細胞增殖的應力加載條件
　　 [目的]
　　 周期性應力加載的力學條件通過Flexercell5000加載系統(tǒng)實現(xiàn)，通過流式細胞術檢測C2C12細胞周期，篩選促C2C12細胞增殖的力學刺激條件。
　　 [方法]
　　 C2C12細胞常規(guī)復蘇后用含100 mg/L的青霉素、100 mg/L的鏈霉素和10％胎牛血清的DME

12、M/F12完全培養(yǎng)基，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將生長狀態(tài)良好的C2C12細胞按1×105/mL密度接種于包被Ⅰ型膠原的Bioflex6孔培養(yǎng)板上貼壁培養(yǎng)24小時后，以0.25Hz頻率、10％拉伸幅度進行2天、4天和6天周期性拉伸;細胞培養(yǎng)分組:①2天對照組:常規(guī)培養(yǎng)。②2天拉伸組:置于Flexercell5000柔性基底加載系統(tǒng)進行每天2小時力學加載，連續(xù)加載2天。③4天對照組:常規(guī)培養(yǎng)，2天后常規(guī)更換培養(yǎng)基。④4天拉伸組:置于F

13、lexercell5000柔性基底加載系統(tǒng)進行每天2小時力學加載，連續(xù)加載4天。⑤6天對照組:常規(guī)培養(yǎng)，第2天和4天后常規(guī)更換培養(yǎng)基。⑥6天拉伸組:置于Flexercell5000柔性基底加載系統(tǒng)進行每天2小時力學加載，連續(xù)加載6天。另外，以1Hz頻率、15％拉伸幅度拉伸1小時，23小時后收集細胞。倒置相差顯微鏡下觀察C2C12細胞形態(tài)、生長情況和細胞脫落情況。分別在相應天數(shù)收集細胞進行流式細胞周期檢測。流式結果用均數(shù)±標準差（(x)±

14、s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗（Independent-Samples TTest），P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 [結果]
　　 C2C12細胞貼壁生長，接種后4小時大部分已貼壁，呈橢圓形或不規(guī)則形，12小時后完全伸展呈梭形及多角形，細胞數(shù)量逐漸增多;采用0.25Hz頻率、10％拉伸幅度的拉伸加載條件:2天時，拉伸組C2C12細胞的增殖情況較對照組明顯;4天時，對照組和拉伸組可見C2C12細胞出現(xiàn)分化

15、，而6天時，兩組均可見細胞部分融合。采用1Hz頻率、15％拉伸幅度的拉伸加載條件:拉伸組的細胞脫落明顯。通過流式細胞術(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測每組3個樣本細胞的分裂增殖周期，C2C12細胞的增殖情況用DNA增殖指數(shù)表達:
　　 [DPI％=(S％+G2/M％)/(S％+G2/M％+G0/G1％)]，2天時，拉伸組DPI％為(37.00±1.43)％，較對照組(21.09±2.72)％明顯增高(P=0.001，

16、n=3);4天時，拉伸組DPI％為(13.89±0.99)％較對照組(11.64±0.80)％增高(P=0.038，n=3)。采用1Hz頻率、15％拉伸幅度的拉伸加載條件:拉伸組凋亡細胞數(shù)量顯著上升。
　　 [結論]
　　 采用0.25Hz頻率，10％拉伸幅度的加載條件進行周期性力學刺激可以明顯促進C2C12細胞增殖，隨著細胞數(shù)量增多及分化融合，促增殖效應逐漸下降。高頻率，大于15％的拉伸幅度的應力加載條件會干擾細胞活性

17、，加速C2C12細胞凋亡。
　　 第二章周期性促增殖應力加載干擾C2C12細胞自身抗原和TLRs表達
　　 [目的]
　　 采用0.25Hz頻率、10％拉伸幅度的促增殖力學刺激條件，進行2天和4天的周期性力學刺激，通過qPCR和Western blot技術檢測C2C12細胞自身抗原(Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70)和TLRs(TLR3和TLR7)基因及蛋白的表達，采用Western blot技術檢

18、測力學信號分子(Calmodulin、NOS、MMP2、HGF、C-met)蛋白的表達。
　　 [方法]
　　 C2C12細胞按1×105/mL密度接種于包被Ⅰ型膠原的Bioflex6孔培養(yǎng)板上貼壁培養(yǎng)24小時，以0.25Hz頻率、10％拉伸幅度進行2天、4天周期性拉伸;細胞培養(yǎng)分組:①2天對照組:常規(guī)培養(yǎng)。②2天拉伸組:置于Flexercell5000柔性基底加載系統(tǒng)進行每天2小時力學加載，連續(xù)加載2天。③4天對照組:

19、常規(guī)培養(yǎng)，2天后常規(guī)更換培養(yǎng)基。④4天拉伸組:置于Flexercell5000柔性基底加載系統(tǒng)進行每天2小時力學加載，連續(xù)加載4天。在相應天數(shù)收集細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，Ol igo(dT)逆轉錄獲取cDNA，經特定引物PCR擴增;用凱基全蛋白試劑盒提取總蛋白，用SDS/PAGE電泳分離后轉膜，孵育一抗二抗后ECL化學發(fā)光法檢測蛋白的表達。結果用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way

20、ANOVA)，若差異有統(tǒng)計學意義，則采用LSD檢驗進行兩兩比較，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 [結果]以0.25Hz頻率、10％拉伸幅度為拉伸加載條件，用qPCR和western blot檢測C2C12細胞自身抗原和TLRs的表達情況:2天時，拉伸組的自身抗原(Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70)和TLR3相對基因和蛋白水平表達較對照組明顯降低（P＜0.001，n=3）;4天時，對照組與拉伸組沒有明顯差異

21、。與2天對照組相比，4天對照組的自身抗原和TLR3表達降低（P＜0.05，n=3)。然而在體外培養(yǎng)的C2C12細胞中，拉伸組和對照組都沒有檢測到TLR7 mRNA和蛋白水平的表達。2天時，拉伸組的力學信號分子（Calmodulin、NOS、MMP2、HGF、C-met）相對蛋白水平表達較對照組明顯增高（P＜0.001，n=3），4天時，拉伸組僅有NOS相對蛋白水平表達高于對照組（P＜0.05，n=3）;而4天對照組與2天對照組比較，MM

22、P2、HGF和C-met表達降低（P＜0.01，n=3)。
　　 [結論]
　　 短期的力學刺激可以抑制自身抗原和TLR3表達，但隨著時間延長，細胞分化融合以及對力學刺激的適應，力學刺激對自身抗原表達抑制作用減弱。而力學信號分子在2天時表達水平較高，隨著刺激天數(shù)增加、細胞分化融合以及對力學刺激的適應，力學信號分子表達下降。因此，在短期力學刺激對自身抗原和TLR3的表達抑制作用中，力學信號分子可能起著關鍵作用。
　　

23、 第三章力學信號分子干擾體外培養(yǎng)C2C12細胞自身抗原及TLR3的表達
　　 [目的]
　　 在培養(yǎng)基中添加特定的力學信號分子的促進劑或拮抗劑，通過qPCR和Western blot技術檢測C2C12細胞自身抗原（Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70）和Toll樣受體TLR3基因及蛋白的表達。
　　 [方法]
　　 當細胞融合達80％左右時，用PBS清洗2次后，分別加入含有鈣離子載體A2318

24、7(3μmol/L)、鈣離子螯合劑EGTA（1.8mmol/L）、調鈣蛋白Calmodulin(1μg/ml)、調鈣蛋白抑制劑Calmidazolium Chloride(0.3μmol/L)、NOS促進劑SNP(30μmol/L)、NOS抑制劑L-NAME(10μmol/L)、MMP-2(10 ng/ml)、MMP-2抑制劑1(250 ng/ml)、重組HGF(20 ng/ml)、anti-HGF兔多抗(2μg/ml)、重組C-met

25、(1μg/ml)、anti-C-met兔多抗(2μg/ml)的DMEM，置于37℃、體積百分比為5％ CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時后收集細胞。用Trizol法提取細胞總RNA，用Oligo(dT)逆轉錄得到cDNA，經特定引物PCR擴增;用凱基全蛋白試劑盒提取總蛋白，用SDS/PAGE電泳分離后轉膜，孵育一抗二抗后ECL化學發(fā)光法檢測蛋白的表達。結果用均數(shù)±標準差((x)±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOV

26、A)，若差異有統(tǒng)計學意義，則采用LSD檢驗進行兩兩比較，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 [結果]
　　 采用qPCR和Westem blot技術對所獲取的C2C12細胞進行檢測:A23187組的自身抗原（Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70）和TLR3的相對基因及蛋白水平的表達較對照組降低（P＜0.001，n=3)，EGTA組則相反;Calmodulin組的自身抗原（HRS和DNA-PKcs）和TLR

27、3相對基因及蛋白水平的表達較對照組降低(P＜0.05，n=3)，Calmidazolium Chloride組的自身抗原（Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70）較對照組升高（P＜0.05，n=3）。SNP組的自身抗原（Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70）和TLR3的相對基因及蛋白水平的表達較對照組降低（P＜0.001，n=3），L-NAME組則相反。MMP-2組的自身抗原（Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-

28、70）和TLR3的相對基因及蛋白水平的表達較對照組沒有明顯差異，MMP-2抑制劑1組的較對照組降低（P＜0.05，n=3)。重組HGF組的自身抗原（HRS、DNA-PKcs和U1-70）和TLR3的相對基因及蛋白水平的表達較對照組降低（P＜0.05，n=3），anti-HGF兔多抗組的自身抗原（Mi-2、HRS和DNA-PKcs）和TLR3較對照組升高(P＜0.05，n=3)。重組C-met組的自身抗原（Mi-2、HRS和U1-70）的

29、相對基因及蛋白水平的表達較對照組降低（P＜0.05，n=3)，anti-C-met兔多抗組的自身抗原(Mi-2、HRS和U1-70)和TLR3較對照組升高(P＜0.05，n=3)。
　　 [結論]
　　 上調C2C12細胞內Calmodulin和NOS能明顯抑制自身抗原和TLR3的基因及蛋白表達。MMP-2的細胞內高濃度對自身抗原和TLR3的相對基因及蛋白水平的表達沒有明顯影響，但MMP-2抑制劑1顯著抑制自身抗原表達。