脂肪酸對(duì)C2C12和L6細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)分化影響的研究.pdf

1、目的：膳食脂肪對(duì)于人體具有很重要的生理功能，既是能量來(lái)源，同時(shí)又提供必需脂肪酸及脂溶性維生素等營(yíng)養(yǎng)成分。但大量文獻(xiàn)說(shuō)明，過(guò)量攝入膳食脂肪是不可取的，膳食中的脂肪含量與種類(lèi)與胰島素抵抗的發(fā)生關(guān)系密切；骨骼肌是由成肌細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，成肌細(xì)胞是一種干細(xì)胞，具有多向分化的潛力，除分化為骨骼肌細(xì)胞外，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下可分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。因此，研究不同種類(lèi)的脂肪酸對(duì)成肌細(xì)胞細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)分化的影響對(duì)于揭示食物中的脂肪成分與胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)

2、系提供科學(xué)依據(jù)。通過(guò)脂肪酸暴露，對(duì)成肌細(xì)胞C2C12和L6在不同條件誘導(dǎo)下的培養(yǎng)和分化，比較成肌細(xì)胞增殖分化特性及其對(duì)不同種類(lèi)脂肪酸的反應(yīng)，從骨骼肌發(fā)育的角度探索不同種類(lèi)的脂肪酸對(duì)成肌細(xì)胞的成肌分化或成脂分化可能具的有不同作用，為相關(guān)研究提供新的策略、方法和模型，為胰島素抵抗相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供重要線索。
　　 方法：1、脂肪酸對(duì)細(xì)胞增殖的劑量效應(yīng)：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12、L6、3T3-L1細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，

3、調(diào)整細(xì)胞濃度為10×105/mL，每孔接種200μL于96孔板，置于37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，按實(shí)驗(yàn)分組依次加入含3％血清，終濃度為200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L和1.25μmol/L的棕櫚酸(palmitate,PA)、油酸(oleicacid，OA)、亞麻酸(linolenate, LA)的培養(yǎng)基以及含3％血清終濃度為0.1％DMSO的培養(yǎng)基，每天換液50％，4天后用MT

4、T比色法計(jì)算五種劑量三種脂肪酸對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率（IR），IR=[（對(duì)照組平均OD490值-實(shí)驗(yàn)組平均OD490值）/對(duì)照組平均OD490]×100％，來(lái)觀察不同脂肪酸對(duì)細(xì)胞增殖的劑量效應(yīng)。2、脂肪酸對(duì)細(xì)胞增殖的時(shí)間效應(yīng)：實(shí)驗(yàn)分組與劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)分組相同，但C2C12、L6、3T3-L1細(xì)胞要分別接種5張板，培養(yǎng)24h后隨機(jī)抽取其中一張板做MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定光吸收值，作為第0天的數(shù)據(jù)，其余4張班每孔按實(shí)驗(yàn)分組依次加人含3％FCS和0.1％DM

5、SO的培養(yǎng)基，含3％FCS終濃度為分別為200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L的PA、OA、LA的培養(yǎng)基，于2天，4天，6天和8天后各取一板做MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定光吸收值，記錄結(jié)果，并按公式計(jì)算IR，來(lái)觀察不同脂肪酸對(duì)細(xì)胞增殖的時(shí)間效應(yīng)。3、脂肪酸對(duì)細(xì)胞分化的影響：選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12、L6細(xì)胞，胰酶消后調(diào)整細(xì)胞濃度50×105/mL，每孔接種400μL于48孔板，培養(yǎng)24h，按

6、實(shí)驗(yàn)分組于分化開(kāi)始的前、分化初期和分化中期分別加25μmol/L的PA、OA、LA處理2天，其余時(shí)間用含2％馬血清的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，共計(jì)培養(yǎng)10天。分別通過(guò)油紅O、姬姆薩染色觀察不同脂肪酸處理隊(duì)細(xì)胞形態(tài)上的影響，通過(guò)計(jì)算肌酸激酶(CK)量的相對(duì)值，進(jìn)一步確定脂肪酸對(duì)細(xì)胞分化的影響。
　　 結(jié)果：1、脂肪酸對(duì)細(xì)胞增殖劑量效應(yīng)：三種脂肪酸在高濃度（200μmol/L）時(shí)都會(huì)顯著抑制C2C12、L6細(xì)胞的增殖，抑制率在60％左右，而對(duì)

7、3T3-L1細(xì)胞增殖的影響較小，抑制率＜35％。低濃度(12.5μmol/L)的PA對(duì)成肌細(xì)胞的抑制大于對(duì)脂肪前體細(xì)胞的抑制：OA五個(gè)濃度對(duì)兩種成肌細(xì)胞增殖的抑制基本相同，但對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖的抑制在40％左右，小于對(duì)成肌細(xì)胞的抑制；LA在低濃度(12.5μmol/L)時(shí)對(duì)三種細(xì)胞的抑制率顯著對(duì)于PA、OA。2、脂肪酸對(duì)細(xì)胞增殖的時(shí)間效應(yīng)：隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪酸隨著對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率不斷加大；脂肪酸對(duì)細(xì)胞抑制的強(qiáng)度3T3-L1＜L6

8、＜C2C12;脂肪酸對(duì)C2C12、L6細(xì)胞增殖的抑制率趨勢(shì)相同，脂肪酸對(duì)L6細(xì)胞增殖的抑制隨著時(shí)間延長(zhǎng)增加較C2C12細(xì)胞緩慢，抑制率增加的幅度不斷減??；脂肪酸對(duì)C2C12、L6細(xì)胞增殖的抑制強(qiáng)度表現(xiàn)為200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L時(shí)PA＞OA=LA,25μmol/L、12.5μmol/L時(shí)PA＞OA＞LA:脂肪酸對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖的抑制強(qiáng)度表現(xiàn)為PA＞OA=LA。3、脂肪酸對(duì)細(xì)胞分化的影響：從油紅O、姬姆

9、薩染色以及CK相對(duì)含量的測(cè)定的結(jié)果可見(jiàn)分化前加處理組與分化初期處理組、分化中期處理組表現(xiàn)出明顯差異，后兩者在細(xì)胞形態(tài)及CK含量方面與對(duì)照基本相同。經(jīng)油紅O、姬姆薩染色后對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，PA、OA處理組處理的細(xì)胞只是有向同一個(gè)方向生長(zhǎng)的趨勢(shì)，但細(xì)胞沒(méi)有融合，或只能見(jiàn)到兩個(gè)細(xì)胞融合，而沒(méi)有出現(xiàn)多核肌管，在細(xì)胞兩端胞漿中大面積出現(xiàn)大小不同的脂滴，LA處理的細(xì)胞，胞漿中脂滴數(shù)較少，脂滴分散，形成明顯的多核肌管，肌管體積比單個(gè)肌細(xì)胞的體積大很

10、多，沿細(xì)胞中心軸線排列形成中心核鏈有10～35個(gè)核不等；肌酸激酶相對(duì)量，PA處理的細(xì)胞是最少的，僅有陰性對(duì)照組的060％～70％,OA處理的細(xì)胞肌酸激酶的相對(duì)量是陰性對(duì)照組的80％多，LA處理的細(xì)胞酸激酶的相對(duì)量分別是陰性對(duì)照組的1.7～1.9倍之間。
　　 結(jié)論：1、不同濃度的脂肪酸對(duì)細(xì)胞增殖的影響不同，隨著濃度的減小，脂肪酸對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率有所減少。不同種類(lèi)脂肪酸對(duì)同種細(xì)胞增殖的影響不同，不飽和脂肪酸對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率小于