GATA4招募PCG蛋白介導(dǎo)miR-29a表達(dá)調(diào)控C2C12細(xì)胞增殖與分化的機(jī)制研究.pdf

1、目的：橫紋肌肉瘤(RMS)是起源于骨骼肌的惡性腫瘤，也是兒童期最常見的軟組織腫瘤，肌祖細(xì)胞增殖和分化失衡是其發(fā)生的主要原因，但相關(guān)分子機(jī)制，目前知之甚少，因此，闡明肌祖細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控機(jī)制，對于揭示橫紋肌肉瘤的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。GATA家族是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合靶基因啟動子區(qū)域的WGATAA序列，從而調(diào)控基因的表達(dá)，其家族成員 GATA4在調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞C2C12的增殖和分化中起著重要作用，但在橫紋肌肉瘤發(fā)生中的機(jī)制，

2、目前尚未闡明。Polycomb復(fù)合體是一組抑制基因轉(zhuǎn)錄的蛋白，其復(fù)合體成員EZH2可通過對GATA4蛋白第299位賴氨酸甲基化從而抑制GATA4的轉(zhuǎn)錄活性。但二者在橫紋肌肉瘤發(fā)生中的機(jī)制，目前尚未闡明。研究表明，microRNA調(diào)節(jié)異常也與橫紋肌肉瘤存在密切關(guān)系。microRNA異常如肌肉特異性microRNA（miR-1、miR-133a/b、miR-206）和miR-29家族異常，都會誘發(fā)橫紋肌肉瘤的發(fā)生，但其精確機(jī)制，還有待于進(jìn)一

3、步闡明。本研究發(fā)現(xiàn)GATA4與EZH2通過調(diào)控miR-29a的表達(dá)，從而調(diào)控成肌細(xì)胞C2C12的增殖和分化，并在橫紋肌肉瘤的發(fā)生中發(fā)揮作用。因此本課題旨在揭示C2C12的增殖和分化及橫紋肌肉瘤發(fā)生的分子機(jī)制，以期為其治療和預(yù)后評估提供理論依據(jù)。
　　方法：⑴生物信息學(xué)軟件預(yù)測，cyclinD2是miR-29a的下游靶基因，本研究中我們采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、MTT法、流式細(xì)胞分析、DAPI染色、熒光素酶報(bào)告基因、QPCR及Westem Bl

4、ot實(shí)驗(yàn)來研究miR-29a靶向cyclinD2，對細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響。⑵采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、QPCR、Westem Blotting、CO-IP和CHIP等實(shí)驗(yàn)方法，研究GATA4調(diào)控miR-29a的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：①M(fèi)TT、流式細(xì)胞分析及DAPI染色結(jié)果表明，miR-29a引起細(xì)胞增殖抑制、周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡。②Luciferase結(jié)果顯示，miR-29a能夠與預(yù)測的cyclinD23’-UTR區(qū)域發(fā)生特異性結(jié)合，從而

5、降低熒光素酶活性。③Western Blotting和QPCR進(jìn)一步證實(shí)了miR-29a可以在蛋白和mRNA水平下調(diào)cyclinD2的表達(dá)，表明miR-29a通過轉(zhuǎn)錄后沉默機(jī)制抑制了cyclinD2的表達(dá)，明確了cyclinD2確為miR-29a的靶基因。④CHIP實(shí)驗(yàn)可知，GATA4招募 PCG蛋白 EZH2(PRC2)，BMI1和RING1B(PRC1)，H3K27me3富集于miR-29a的啟動子區(qū)域，使其處于抑制狀態(tài)。⑤CO-I

6、P實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示GATA4與EZH2存在細(xì)胞內(nèi)相互作用，這些結(jié)果初步闡明GATA4抑制miR-29a轉(zhuǎn)錄活性的內(nèi)在分子機(jī)制。⑥Western Blotting和QPCR證實(shí)，GATA4能夠在mRNA水平抑制miR-29a，在蛋白和mRNA水平促進(jìn)cyclinD2的表達(dá)。⑦C2C12分化過程中的CHIP實(shí)驗(yàn)可知，GATA4與 PCG蛋白不結(jié)合到miR-29a的啟動子區(qū)域。
　　結(jié)論：⑴miR-29a通過下調(diào)其下游靶基因cyclinD