篩選膀胱癌尿液新標(biāo)記物Gc-globulin的熒光差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、膀胱癌是泌尿系統(tǒng)威脅人類健康最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率不斷上升。世界范圍內(nèi)，膀胱癌位列男性最常見實(shí)體瘤的第四位，在女性位列第七位，每年新診斷的膀胱癌患者超過(guò)350，000名。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)2010年美國(guó)膀胱癌新發(fā)病例為70，530例，死亡病例為14，680例。在我國(guó)，膀胱癌目前仍是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，且發(fā)病率呈現(xiàn)穩(wěn)中有升的趨勢(shì)。臨床特點(diǎn)為一旦腫瘤侵襲漿膜層則復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差。膀胱癌患者中超過(guò)90％為尿路上皮癌，首次確

2、診為膀胱癌的患者中，55％～60％為低級(jí)別尿路上皮癌。低級(jí)別尿路上皮癌即使經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)那粌?nèi)或開放治療，仍有很高的復(fù)發(fā)率。通常，復(fù)發(fā)仍為分化較好的低級(jí)別尿路上皮癌，但仍有16％～25％的患者腫瘤病理分級(jí)增加，且大約10％低級(jí)別尿路上皮癌可發(fā)展為肌層浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。膀胱低級(jí)別尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多基因及多途徑改變的復(fù)雜過(guò)程。
　　 在目前臨床工作中，膀胱鏡檢查是發(fā)現(xiàn)，診斷及監(jiān)測(cè)膀胱癌復(fù)發(fā)和進(jìn)展的金標(biāo)準(zhǔn)。反復(fù)的膀胱鏡檢查在疾

3、病早期階段促使患者接受有效的治療，因此潛在地減緩了疾病向肌層侵襲的進(jìn)展。然而，膀胱鏡是一種侵襲性、費(fèi)時(shí)和昂貴的檢查手段，不能夠很好地被患者接受和配合。尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查仍是輔助膀胱鏡的一種非侵襲性的檢查手段，特別是在發(fā)現(xiàn)高侵襲性膀胱癌方面具有很高的敏感度，但在低度惡性的病變方面其敏感度較低，并且它的準(zhǔn)確性依賴于病理醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)。因此，在篩查、早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)測(cè)淺表腫瘤向侵襲性進(jìn)展方面，致力于尋找具有高敏感度和特異度、可信賴的非侵襲性標(biāo)記物具有重

4、要的臨床意義。迄今為止，臨床常規(guī)流程中，仍沒有敏感度和特異度高的血清或尿液腫瘤診斷標(biāo)志物用以發(fā)現(xiàn)及跟蹤隨訪膀胱癌患者。
　　 雖然基于基因水平的基礎(chǔ)研究可以為膀胱癌疾病的發(fā)生，發(fā)展分子機(jī)制的解讀提供有力的依據(jù)，但是這些研究往往強(qiáng)調(diào)單個(gè)或者少數(shù)幾個(gè)分子的作用，缺乏蛋白質(zhì)水平的整體性、整合性及系統(tǒng)性的研究。歸根結(jié)底，蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的直接執(zhí)行者，且某些基因的表達(dá)產(chǎn)物可能不只一個(gè)，而且基因的表達(dá)方式錯(cuò)綜復(fù)雜，同樣的一個(gè)基因在不同的機(jī)體

5、周圍環(huán)境和不同的機(jī)體生理狀態(tài)下，會(huì)產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)，發(fā)揮完全不同的作用?；蚪Y(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)的復(fù)雜性和多變性存在巨大的反差。此外，對(duì)于功能蛋白質(zhì)，還涉及到蛋白質(zhì)的后期加工、修飾以及轉(zhuǎn)運(yùn)定位的過(guò)程，這些過(guò)程是基因不能決定的;但這些過(guò)程中的任何一個(gè)步驟發(fā)生微細(xì)的差錯(cuò)即可導(dǎo)致機(jī)體的疾病。另外，miRNA的發(fā)現(xiàn)也使我們意識(shí)到即使是在mRNA上表達(dá)有差異，但由于miRNA對(duì)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控，也有可能在相應(yīng)的蛋白質(zhì)水平上表達(dá)有差異。因

6、此，膀胱癌疾病蛋白水平的研究是不容忽視的重要課題。
　　 蛋白質(zhì)組是一個(gè)在時(shí)間和空間上動(dòng)態(tài)變化著的整體，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白組成成分，表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，以及蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。研究體液的蛋白質(zhì)組學(xué)模式的出現(xiàn)在早期發(fā)現(xiàn)癌癥方面尋找新的、高敏感度的診斷工具提供新的機(jī)會(huì)。臨床蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的主要目的是在體液中尋找能夠鑒別疾病的標(biāo)志物，可以相對(duì)廉價(jià)的檢測(cè)并早期診斷疾病。

7、目前而言，血清或血漿蛋白質(zhì)組學(xué)受到廣泛關(guān)注。由于尿液可直接接觸腫瘤并且樣本易于獲取，在疾病的早期發(fā)現(xiàn)及疾病監(jiān)測(cè)方面，尿液相對(duì)于用血漿來(lái)發(fā)現(xiàn)膀胱癌潛在的標(biāo)志物而言是一個(gè)有吸引力的選擇。盡管現(xiàn)在一些同時(shí)存在于血液和尿液中的蛋白已經(jīng)被作為膀胱癌的標(biāo)記物，如膀胱癌抗原、核基質(zhì)蛋白和纖維蛋白原代謝產(chǎn)物;但是其特異性和敏感性都欠理想。運(yùn)用蛋白組學(xué)技術(shù)從尿液樣本中來(lái)研究膀胱癌尿液相關(guān)蛋白以篩選，診斷及監(jiān)測(cè)預(yù)后是目前研究重要的趨勢(shì)。
　　 目前

8、為止，已有不少研究運(yùn)用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜鑒定技術(shù)以識(shí)別在膀胱癌尿液中差異表達(dá)的蛋白，并且應(yīng)用考馬斯染色、銀染或放射標(biāo)記染色法標(biāo)記尿蛋白提取物。如2009年Feldman.etal運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)策略分析了膀胱癌患者和正常對(duì)照人群的尿液差異蛋白，并對(duì)興趣蛋白Cystatin B進(jìn)一步在組織中應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)和在尿液中用半定量的Western blot技術(shù)進(jìn)行分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿液中Cystatin B的表達(dá)水平與腫瘤的分級(jí)(P=0.06

9、2)，分期(P=0.0047)及腫瘤復(fù)發(fā)(P=0.0104)和進(jìn)展(P=0.0007)的時(shí)間正相關(guān)。2011年Li.etal[8]通過(guò)運(yùn)用雙向電泳篩選健康志愿者和低度惡性及侵襲性膀胱癌患者的尿液樣本，以期識(shí)別能夠早期檢測(cè)膀胱癌的生物標(biāo)記物。他們觀察到纖維蛋白原、乳酸脫氫酶B、載脂蛋白A1、叢生蛋白和觸珠蛋白等5個(gè)蛋白在低度惡性或侵襲性膀胱癌患者尿液中表達(dá)增高。進(jìn)一步對(duì)尿液樣本分析后發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于低度惡性膀胱癌，載脂蛋白A1在侵襲性膀胱癌中

10、表達(dá)顯著增高。應(yīng)用ELISA法測(cè)定載脂蛋白A1的水平，發(fā)現(xiàn)在18.22ng/ml水平其具有可以從正常人群中辨別膀胱癌患者的診斷效能（敏感度和特異度分別為91.6％和85.7％），并認(rèn)為其濃度在29.86ng/ml水平可辨別侵襲性膀胱癌患者和低度惡性膀胱癌患者（敏感度和特異度分別為83.7％和89.7％）。
　　 然而，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的改進(jìn)，熒光差異雙向凝膠電泳技術(shù)為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究是研究的趨勢(shì)。熒光差異凝膠電泳技術(shù)可在同

11、一塊膠上同時(shí)分離多個(gè)分別由不同熒光標(biāo)記的樣品。由于不同的熒光標(biāo)記樣品有不同的激發(fā)波長(zhǎng)，可通過(guò)不同的濾光片記錄互不干擾的膠圖結(jié)果。由于有了多色熒光標(biāo)記，使得在同一塊膠中分離并分析多個(gè)樣本成為可能。這樣有效避免了不同膠間的系統(tǒng)誤差，特別適合比較不同樣本間差異。1997年，Unlu等發(fā)表了第一篇熒光差異凝膠電泳的論文，將不同的樣品分別用不同的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記后混合在同一塊凝膠中進(jìn)行雙向電泳，極大地提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和定量的準(zhǔn)確性。據(jù)我們所

12、知，應(yīng)用熒光標(biāo)記尿蛋白提取物進(jìn)行雙向凝膠電泳的技術(shù)報(bào)道比較罕見。僅Orenes-Pinero等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)可以運(yùn)用熒光差異雙向凝膠電泳蛋白組學(xué)策略來(lái)探索診斷膀胱癌的尿液標(biāo)記物。
　　 本研究正式立足于尿液蛋白質(zhì)組學(xué)水平，建立規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)的收集臨床標(biāo)本工作流程，制定科學(xué)合理的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，在收集足夠膀胱癌患者和健康對(duì)照人群尿液樣本的基礎(chǔ)上，按照病理診斷結(jié)果進(jìn)行分組（低級(jí)別尿路上皮癌組，高級(jí)別尿路上皮癌組和浸潤(rùn)性尿路上皮癌組），利用

13、反復(fù)超濾和除鹽份的方法濃縮，純化尿液蛋白，利用熒光差異雙向凝膠電泳進(jìn)行篩選及分離，電泳后用Typhoon9400成像系統(tǒng)掃描凝膠并用DeCyder軟件分析差異蛋白。運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間技術(shù)對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行鑒定，聯(lián)合生物信息學(xué)方法以選取感興趣的候選蛋白(Gc-globulin)。待對(duì)候選蛋白驗(yàn)證其結(jié)果可靠性后，對(duì)大量臨床膀胱癌患者尿液和對(duì)照組尿液樣本進(jìn)行ELISA定量檢測(cè)GC的濃度，結(jié)合已檢測(cè)臨床標(biāo)本的臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以

14、建立候選蛋白分子標(biāo)記物GC與膀胱癌疾病的聯(lián)系，進(jìn)一步確定有效診斷和監(jiān)測(cè)膀胱癌疾病的蛋白分子標(biāo)記物，對(duì)于研究膀胱癌的發(fā)病機(jī)制，診斷方法，疾病監(jiān)測(cè)和治療方法等方面的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 目前運(yùn)用熒光差異雙向凝膠電泳的蛋白組學(xué)技術(shù)研究膀胱癌尿液蛋白的文獻(xiàn)報(bào)道比較少，為此開展篩選膀胱癌尿液新標(biāo)記物Gc-globulin的熒光差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究正是立足于從尿液蛋白水平獲取理想的膀胱癌診斷，進(jìn)展及預(yù)后分子標(biāo)記物，闡述相關(guān)的發(fā)病機(jī)制。無(wú)疑對(duì)深

15、入了解膀胱癌疾病的發(fā)生，發(fā)展及預(yù)后問(wèn)題，是具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義的研究項(xiàng)目。
　　 研究方法
　　 （一）臨床資料和標(biāo)本收集
　　 (1)膀胱癌組尿液標(biāo)本來(lái)自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院泌尿外科住院患者。所有膀胱癌的患者經(jīng)術(shù)前CT或逆行腎盂輸尿管造影來(lái)確定上尿路沒有病變。這些患者都有最初診斷的陽(yáng)性結(jié)果或者膀胱鏡檢查指證。膀胱鏡檢查前收集患者尿標(biāo)本。正常對(duì)照組尿液標(biāo)本來(lái)南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院體檢中心健康人群。尿液標(biāo)本收集后

16、立即冷卻到4℃，然后在4個(gè)小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)移到-80℃儲(chǔ)存。詳細(xì)登記好病人的臨床資料特別是膀胱鏡檢查組織病理結(jié)果，術(shù)后病理結(jié)果及臨床診斷結(jié)果?；颊咦栽妇璜I(xiàn)并簽定知情同意書。本研究經(jīng)南方醫(yī)院倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn):1:伴有腎臟疾病尿蛋白陽(yáng)性的患者;2:伴有除膀胱癌外其他泌尿系腫瘤的患者;3:伴有不明原因的肉眼血尿的患者（電泳時(shí)）;4:伴有嚴(yán)重的泌尿系感染的患者（電泳時(shí)）。
　　 （二）候選蛋白標(biāo)記物的篩選(1)選取正常對(duì)照組和膀胱癌

17、組尿液標(biāo)本各12例，其中低級(jí)別尿路上皮癌，高級(jí)別尿路上皮癌和浸潤(rùn)性尿路上皮癌樣本各4例。將樣本從-80℃冰箱拿出，融解后即刻添加蛋白酶抑制劑(50:1)，采用反復(fù)超濾離心洗滌的方法聯(lián)合除鹽方法濃縮，純化尿液蛋白。用Bradford方法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。
　　 (2)運(yùn)用雙向凝膠電泳構(gòu)建穩(wěn)定性好，重復(fù)性高的人尿液雙向電泳圖譜
　　 (2.1)蛋白樣品和上樣緩沖液共450μL充分混合，用24 cm IPG干膠條采取被動(dòng)泡漲1

18、3h，等電聚焦條件為500 V1h，1，000 V1h，5，000 V1h，8，000 V60KVh，500 V3h。聚焦完畢后將膠條先后平衡兩次，隨后將膠條移至12.0％的SDS-PAGE膠上端進(jìn)行第二向電泳，直至溴酚藍(lán)達(dá)膠底線。
　　 (2.2)銀染40.0％乙醇，10.0％冰醋酸固定2次，每次15 min;30.0％乙醇，0.2％Na2S2O3，6.8％乙酸鈉敏化30min;蒸餾水洗3次，每次5 min;2.50‰AgNO

19、3染色20min;蒸餾水洗2次，每次1min;2.5％Na2CO3，0.04‰甲醛顯影至蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰;立即加入5.0％冰醋酸終止10 min;蒸餾水洗3次，每次5min;最后用30.0％乙醇，4.6％甘油保存。
　　 (2.3)凝膠通過(guò)UMAX PowerLook1100投射掃描儀進(jìn)行掃描獲取2-DE凝膠圖像，利用Melanie4分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。
　　 (3)運(yùn)用熒光差異雙向凝膠電泳技術(shù)對(duì)正常對(duì)照組和膀胱癌組尿液

20、蛋白進(jìn)行分離及篩選差異蛋白
　　 (3.1)將正常對(duì)照組和膀胱癌組尿液組各組樣品pH值調(diào)至8.5;每份樣本50μg(5～10μl)避光條件下加入1μl(400 pmol)的CyDye Cy3、Cy5、Cy2熒光染料工作液，其中Cy2作為內(nèi)標(biāo)標(biāo)記兩組尿液蛋白樣品混合物，Cy3標(biāo)記健康對(duì)照組尿液蛋白樣品，Cy5標(biāo)記膀胱癌組尿液蛋白樣品。
　　 (3.2)將標(biāo)記熒光染料的樣品進(jìn)行雙向電泳，步驟與普通雙向電泳相同。
　　

21、 (3.3)直到溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端結(jié)束雙向電泳。用Typhoon9400成像系統(tǒng)掃描熒光凝膠，各熒光染料的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為:Cy2:480nm和530nm，Cy3:540nm和590nm，Cy5:620 nm和680 nm。掃描后的圖像文件用DeCyder5.0版本軟件分析，應(yīng)用BVA模式進(jìn)行膠與膠之間的匹配，不同組間選擇Student-t檢驗(yàn)。挑選出兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且差異倍數(shù)＞2.0的顯著增加或者顯著減少的感興趣差異蛋白點(diǎn)

22、。
　　 (3.4)取對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組蛋白樣品各500μg，按常規(guī)方法進(jìn)行制備膠雙向電泳后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，用機(jī)械手臂挖取與感興趣差異蛋白相匹配的蛋白點(diǎn)。對(duì)所挖取蛋白點(diǎn)用50％乙腈沖洗、胰蛋白酶消化、并在靶條上進(jìn)行標(biāo)肽和蛋白樣品點(diǎn)樣后，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)肽質(zhì)量指紋譜，并將結(jié)果輸入NCBI和SWISS-PROT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。
　　 （三）應(yīng)用生物信息學(xué)方法選定候選蛋白GC借助生物信息學(xué)

23、研究手段如:SWISS-PROT，String和Pubgene等工具對(duì)所鑒定蛋白分析所參與的生物學(xué)過(guò)程、蛋白質(zhì)間的相互作用及蛋白質(zhì)特有的結(jié)構(gòu)和功能等，以便選取候選蛋白進(jìn)行進(jìn)一步研究。
　　 （四）候選蛋白GC在健康人群和膀胱癌患者尿液中的表達(dá)
　　 (1)候選蛋白的Western Blot驗(yàn)證:選取正常對(duì)照組尿液標(biāo)本8例;膀胱癌組尿液標(biāo)本8例，其中低級(jí)別尿路上皮癌2例，高級(jí)別尿路上皮癌2例和浸潤(rùn)性尿路上皮癌4例。每個(gè)樣本

24、各自提取尿液總蛋白定量后，每孔加入約30μg蛋白，10％SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5％脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉1h，封閉一抗、二抗后由ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)，壓底片曝光后顯影。
　　 (2)選取144例尿液樣本運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)GC濃度，其中正常對(duì)照組42例;膀胱良性病變11例和膀胱癌組91例。根據(jù)世界衛(wèi)生組織膀胱癌的分類標(biāo)準(zhǔn):浸潤(rùn)性尿路上皮癌23例和非浸潤(rùn)性尿路上皮癌68例（低級(jí)別尿路上皮癌3

25、8例，高級(jí)別尿路上皮癌30例）。
　　 （五）候選蛋白GC濃度與相關(guān)臨床資料的統(tǒng)計(jì)分析待健康人群和膀胱癌患者中候選蛋白濃度定量檢測(cè)后，根據(jù)臨床資料如:年齡，性別，腫瘤的原發(fā)/復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移/未轉(zhuǎn)移，伴/不伴血尿，病理分級(jí)等進(jìn)行亞組分析;還有通過(guò)ROC曲線來(lái)確定用于診斷膀胱癌/區(qū)分浸潤(rùn)性膀胱癌的cut-off值，并計(jì)算相應(yīng)的特異度和敏感度。
　　 （六）候選蛋白GC在正常對(duì)照和膀胱癌組織中的表達(dá)
　　 (1)差異表達(dá)蛋

26、白的Western Blot驗(yàn)證:對(duì)單個(gè)的正常對(duì)照組和膀胱癌組織樣本運(yùn)用液氮研磨的方法提取總蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。
　　 (2)差異表達(dá)蛋白的免疫組織化學(xué)技術(shù)驗(yàn)證:選取正常對(duì)照組標(biāo)本10例;膀胱癌標(biāo)本26例的石蠟包塊進(jìn)行研究。其中低級(jí)別尿路上皮癌8例，高級(jí)別尿路上皮癌8例和浸潤(rùn)性尿路上皮癌10例。石蠟切片常規(guī)脫臘入水，接著用3％H202-甲醇10分鐘后，水洗，再用PBS洗3次后，加生物素標(biāo)記的特異性一抗，37℃30分鐘，置濕盒內(nèi)

27、。PBS洗3次，加酶標(biāo)記的卵白素，37℃30分鐘，PBS洗3次，DAB顯色后，流水沖洗，復(fù)染、脫水、封片。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.對(duì)收集的人尿液樣品進(jìn)行反復(fù)超濾及除鹽優(yōu)化處理后，可成功地獲得人尿液樣本分辨率高、重復(fù)性好的雙向電泳圖譜;
　　 2.成功構(gòu)建了膀胱癌組和正常對(duì)照組尿液樣本的2D-DIGE圖譜，對(duì)其中24個(gè)差異超過(guò)2倍的差異點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，共鑒定出16個(gè)不同的蛋白。其中ALB，GC，HP，F(xiàn)GB，

28、APOA1，RBP4和SECTM1等7個(gè)蛋白在膀胱癌組中的尿液樣品中高表達(dá)，剩余UMOD，KNG1，AMY1A，AMY2A，ITIH4，AMBP， HSPG2，CST5和MASP2等9個(gè)蛋白在膀胱癌組中低表達(dá);
　　 3.String和Pubgene等生物信息學(xué)分析提示GC蛋白在生長(zhǎng)，發(fā)病機(jī)理，分泌，翻譯，細(xì)胞凋亡，死亡，消化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過(guò)程起著重要的作用，且GC蛋白與其他已鑒定的差異蛋白有著密切的聯(lián)系，可作為候選蛋白;

29、r>　　 4.GC蛋白的Westem blotting結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)GC在膀胱癌組尿液樣品中的表達(dá)水平要高于正常對(duì)照組，有顯著性差異。Western blotting結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果一致。
　　 5.膀胱癌組織中的GC蛋白的表達(dá)要高于癌旁組織的表達(dá)。通過(guò)兩組的免疫組織化學(xué)結(jié)果也發(fā)現(xiàn):GC在移行上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的胞漿中表達(dá)，染色較正常對(duì)照組強(qiáng)。提示GC在膀胱癌組中表達(dá)上調(diào);
　　 6.膀胱癌組GC蛋白濃度為1013

30、.70±851.25 ng/mg，良性病變組GC蛋白濃度為105.32±47.81ng/mg，正常對(duì)照組GC蛋白濃度為99.34±55.87 ng/mg。膀胱組與良性病變組和正常對(duì)照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），但良性病變組和正常對(duì)照組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。按照病理級(jí)別分組，低級(jí)別尿路上皮癌GC蛋白濃度為472.92±348.02 ng/mg，高級(jí)別尿路上皮癌GC蛋白濃度為1014.06±753.16 ng/mg，浸潤(rùn)性尿路上皮癌GC

31、蛋白濃度為1906.69±840.86ng/mg;且三組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 7.ROC分析示采用161.086 ng/mgGC蛋白濃度來(lái)篩選膀胱癌，相應(yīng)的敏感度和特異度為92.31％和83.02％;當(dāng)尿液中GC蛋白濃度大于1407.481 ng/mg時(shí)，提示為浸潤(rùn)性膀胱癌，其敏感度和特異度為82.61％和88.24％。
　　 結(jié)論
　　 1.建立了穩(wěn)定性高，重復(fù)性較好的人尿液蛋白組雙向凝膠電泳技術(shù)和方法，為

32、人膀胱癌尿液蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ);
　　 2.運(yùn)用熒光差異蛋白組學(xué)方法比較了膀胱癌組和正常對(duì)照組尿液樣本蛋白圖譜;
　　 3.對(duì)24個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，共鑒定出16個(gè)不同的蛋白。其中ALB，GC，HP，F(xiàn)GB，APOA1，RBP4和SECTM1等7個(gè)蛋白在膀胱癌組中的尿液樣品中高表達(dá)，剩余UMOD，KNG1，AMY1A，AMY2A，ITIH4，AMBP， HSPG2，CST5和MASP2等9個(gè)蛋白在膀胱癌