廣東省1985～2013年非O1-O139群霍亂弧菌分子特征的研究.pdf

1、研究目的和意義：
　　1.比較分析廣東省霍亂流行期和流行間歇期，不同來源的非O1/O139群霍亂菌株菌株分子特征。
　　2.在分子水平上了解不同流行態(tài)勢下，非O1/O139群霍亂弧菌毒力基因的攜帶情況，并探討其流行規(guī)律。
　　3.探討不同PFGE克隆型與毒力基因攜帶情況的相關性，確定霍亂菌株的分子流行病學特征，為追蹤菌株的來源和變遷，疫情態(tài)勢評判提供科學、客觀的依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.運用流行病學基

2、本理論，描述1985～2013年廣東省不同來源的219株非O1/O139群霍亂弧菌菌株分布特征。
　　2.采用傳統(tǒng)的生化鑒定和血清分型試驗對菌株進行復核鑒定。
　　3.運用PCR的方法檢測CTX基因元件（ctxB、rstR4、rstR6、rstR232、rstR-18、rstR264、rstRclac、rstRclass、rstRElTor）、VPI毒力島（tcpⅠ、tcpAEl Tor）、VSP-Ⅰ(O175、O178、O

3、180、O183、O185)、VSP-Ⅱ(O490、O493、O498、O502、O504、O512、O514、O516)以及其它毒力基因(chxA、VCS(N2)、SXT、ST、rtxA、IS1004、hlyA、mshA）。
　　4.采用脈沖場凝膠電泳(PFGE)方法對菌株進行分子分型，并用BioNumerics軟件進行聚類分析。
　　研究內(nèi)容：
　　1.流行病學信息:將收集的219株非O1/O139群霍亂弧菌菌株基

4、本信息運用流行病學基本理論進行描述性研究，分析不同年代、不同地區(qū)及不同來源的菌株分布情況，進一步比較廣東省非O1/O139群霍亂菌株菌株的優(yōu)勢菌群和流行趨勢及變化。
　　2.菌株的復蘇培養(yǎng)鑒定及血清分型:將廣東省疾病預防控制中心菌種庫中非01/0139群霍亂弧菌冷凍干燥菌株進行復蘇，純培養(yǎng)后進行生化鑒定及血清分型。比較分析不同流行期間廣東省非O1/O139群霍亂弧菌菌株血清型分布情況。
　　3.毒力基因檢測:應用PCR方法對

5、CTX基因元件（ctxB、rstR4、rstR6、rstR232、rstR-18、rstR264、rstR、rstRclac、rstRclass、rstRElTor）、VPI毒力島(tcpⅠ、tcpAETor)、VSP-Ⅰ(O175、O178、O180、O183、O185)、VSP-Ⅱ(O490、O493、O498、O502、O504、O512、O514、O516)以及其它毒力基因(chxA、VCS(N2)、SXT、ST、rtxA、IS

6、1004、hlyA、mshA）進行檢測，計算陽性率及毒力基因型別，分析廣東省非O1/O139群霍亂弧菌毒力基因攜帶情況，為進一步研究非O1/O139群霍亂弧菌致病機理提供基礎數(shù)據(jù)。并進一步比較分析廣東省1985～2013年間，不同年代、不同地區(qū)、不同來源收集的非O1/O139群霍亂菌株攜帶的毒力基因情況，在分子水平上了解非O1/O139群霍亂弧菌毒力基因的分布特點和變遷，探討其流行規(guī)律。
　　4.PFGE分子分型:采用脈沖場凝膠電

7、泳(PFGE)方法對菌株進行分子分型，并運用Bionumerics6.6軟件將PFGE帶型比對分析，計算相似度，繪制PFGE聚類圖譜。探討不同PFGE克隆型與毒力基因的關聯(lián)，追蹤菌株的來源和變遷。
　　主要結果：
　　219株非O1/O139群霍亂弧菌主要分布在霍亂大流行期間，其中，1985～1989年分離到的非O1/O139群霍亂弧菌131株，為病人來源（110株）和外環(huán)境水體來源（21株），并主要分布在湛江（67株）、廣

8、州（20株）、汕頭（16株）、?？冢?4株）（（1988年海南獨立成省，之前都隸屬于廣東?。┑貐^(qū);1990～1999年，非O1/O139群霍亂弧菌菌株31株，病人（17株）、外環(huán)境水體（11株）以及水產(chǎn)品（3株）來源均有檢出，且主要分布在陽江（13株）和廣州（7株）地區(qū);自2001后，非O1/O139群霍亂弧菌菌株數(shù)目已連續(xù)4年呈下降趨勢，2007年出現(xiàn)小幅度回升，2012年又有一定的上升，各地區(qū)呈散在分布。
　　血清分型結果顯示

9、，219株非O1/O139群霍亂弧菌分屬于VBO2，4，6，7，8,10,11,12,13,14,18,22,23,25,28,29,30,32,38,39,45,46,51，71，76，84，140，141和155共29個血清型，血清型較分散復雜，分型率達27.40％，遠低于已發(fā)現(xiàn)的200個以上非O1/O139群霍亂弧菌血清型范圍。
　　毒力基因分析結果顯示，僅13株非O1/O139群霍亂弧菌菌株含有ctxB毒力基因，經(jīng)進一步測

10、序后發(fā)現(xiàn)均為EL Tor型，其中病人來源占76.92％(10/13)，外環(huán)境水體來源占23.08％(3/13)。其中，1985～1987年霍亂大流行期間監(jiān)測到7株病人來源的非O1/O139群霍亂弧菌產(chǎn)毒株，1996和1998年也監(jiān)測到2株病人來源的非O1/O139群霍亂弧菌產(chǎn)毒株，1999年監(jiān)測到3株外環(huán)境水體來源的非O1/O139群霍亂弧菌產(chǎn)毒株，而2000年后的監(jiān)測中已無非O1/O139群霍亂弧菌產(chǎn)毒株檢出。33株非O1/O139群

11、霍亂弧菌攜帶不同種類的rstR毒力基因，15株非O1/O139群霍亂弧菌tcpA陽性，同時檢測到tcpⅠ也是陽性。CTX性噬菌體及TCP毒力基因分布情況為:ctxB+rstR+tcpA+tcpⅠ+(n=13)，ctxB-rstR+tcpA-tcpⅠ+(n=18)，ctxB-rstR+tcpA+tcpⅠ+(n=2)。病人來源的菌株中48.32％(72/149)攜帶不同種類的VSP島毒力基因，其中，僅有3株攜帶完整的VSP毒力島基因，其他菌

12、株均攜帶部分VSP-Ⅰ或者VSP-Ⅱ毒力島基因;外環(huán)境水體來源的菌株中46.43％(26/56)攜帶不同種類的VSP毒力島基因，其中，僅有1株攜帶完整的VSP毒力島基因，其他菌株均攜帶部分VSP-Ⅰ或者VSP-Ⅱ毒力島基因;水產(chǎn)品來源的菌株中64.29％(9/14)攜帶不同種類的VSP毒力島基因，沒有攜帶完整的VSP毒力島基因的菌株，均攜帶部分VSP-Ⅰ或者VSP-Ⅱ毒力島基因。8個潛在毒力基因檢測結果顯示，病人來源菌株中35.57％(

13、53/149)含有chxA毒力基因，62.42％(93/149)含有TTSS(vcsC2)基因，14.10％(21/149)含有SXT毒力基因，2.01％(3/149)含有ST毒力基因，95.97％(143/149)含有rtxA毒力基因，96.64％(144/149)含有mshA毒力基因，89.26％(133/149)含有ISI004毒力基因，93.29％(139/149)含有hlyA毒力基因。外環(huán)境水體來源菌株中55.36％(31/5

14、6)含有chxA毒力基因，33.93％(19/56)含有T7SS(vcsC2)毒力基因，14.29％(8/56)含有SXT毒力基因，1.79％(1/56)含有ST毒力基因，78.57％(44/56)含有rtxA毒力基因，87.5％(49/56)含有mshA毒力基因，64.29％(36/56)含有ISI004毒力基因，85.71％(48/56)含有hlyA毒力基因。水產(chǎn)品來源菌株中71.43％(10/14)含有chxA毒力基因，57.14

15、％(8/14)含有TTSS(vcsC2)基因，7.14％(1/14)含有SXT毒力基因，7.14％(1/14)含有ST毒力基因，85.71％(12/14)含有rtxA毒力基因，92.86％(13/14)含有mshA毒力基因，85.71％(12/14)含有ISI004毒力基因，100％(14/14)含有hlyA毒力基因。
　　主要結論：
　　1.1985～1989年分離到的非O1/O139群霍亂弧菌較多，為病人來源和外環(huán)境水體

16、來源，并主要分布在湛江、廣州、汕頭、?？?1990～1999年，非O1/O139群霍亂弧菌菌株數(shù)目明顯減少，且主要分布在陽江和廣州地區(qū);自2001后，非O1/O139群霍亂弧菌菌株數(shù)目已連續(xù)4年呈下降趨勢，2007年出現(xiàn)小幅度回升，2012年又有一定的上升，各地區(qū)呈散在分布。
　　2.血清型較為分散復雜，分型率達到27.40％，但遠低于已發(fā)現(xiàn)的200多種非O1/O139群霍亂弧菌的血清型范圍，因此應加快研發(fā)生產(chǎn)更加廣泛的非O1/O

17、139群霍亂弧菌分型診斷血清，及時發(fā)現(xiàn)新的血清型別，提高分型率。
　　3.毒力基因檢測發(fā)現(xiàn)僅13株非O1/O139群霍亂弧菌菌株含有ctxB毒力基因，經(jīng)進一步測序后發(fā)現(xiàn)均為EL Tor型。毒力基因特征多樣，存在ctxB基因缺失，表現(xiàn)為TCP、VSP-Ⅰ/Ⅱ毒力島基因元件部分陽性，具備此基因特征的菌株一般僅引起散發(fā)的腹瀉病例，但仍應密切關注此類菌株數(shù)量的增加。
　　4.PFGE分型發(fā)現(xiàn)菌株間無明顯的聚類，且不同年份以及不同地區(qū)