2007～2013年廣東省腹瀉病例副溶血弧菌分離株的病原特征分析.pdf

1、研究目的:
　　1.了解廣東省2007-2013年腹瀉病例副溶血弧菌分離株的血清型別和毒力基因的分布情況，掌握副溶血弧菌流行的優(yōu)勢血清型及致病性副溶血弧菌的分布情況。
　　2.了解廣東省2007-2013年腹瀉病例副溶血弧菌分離株中“大流行菌群”的分布情況，確定廣東地區(qū)是否存在副溶血弧菌的優(yōu)勢克隆群。
　　3.了解廣東省2007-2013年腹瀉病例副溶血弧菌分離株的種群結(jié)構(gòu)及進化關(guān)系。
　　研究方法:
　　

2、1.菌株來源:本研究所使用的副溶血弧菌菌株均來源于廣東省疾病預(yù)防控制中心2007-2013年通過食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)所收集得到的腹瀉病例分離株，共469株。收集范圍涵蓋廣東省內(nèi)15個地級市。所有菌株均經(jīng)廣東省疾病預(yù)防控制中心病原微生物檢驗所進行復(fù)核鑒定后，冷凍干燥保存于-70℃的環(huán)境下。
　　2.血清學(xué)分型:將副溶血弧菌于3％ NaCl TSA斜面上37℃培養(yǎng)24h。挑選菌群，使用副溶血弧菌血清試劑盒進行菌體抗原(O)與莢膜抗原(K

3、)的凝集試驗。
　　3.毒力基因檢測:采用PCR擴增的方法檢測tdh和trh、GS-PCR和orf8基因。副溶血弧菌“大流行菌群”的判定標(biāo)準(zhǔn)為:①1996年以后分離;②TDH陽性;③TRH陰性;④GS-PCR(group-specific PCR)陽性和/或orf8陽性。
　　4.MLST:挑取150株具有代表性的菌株對其7個管家基因(housekeeping genes，HK genes)進行PCR擴增和基因測序。7個等位

4、基因分別為:dnaE（編碼DNA聚合酶Ⅲ，α亞基）、recA（編碼RecA蛋白）、gyrB（編碼DNA解旋酶，B亞基）、dtdS（編碼2-氨基-3羥基丁酸脫氫酶）、pntA（編碼轉(zhuǎn)氫酶α亞基）、pyrC（編碼二氫乳清酸）和tnaA（編碼色氨酸酶）。將序列信息上傳至PubMlst網(wǎng)站進行比對，以確認等位基因和序列型別(Sequence Types，STs);應(yīng)用eBURST軟件對菌株的ST型別進行分析，確定同源復(fù)合體等信息;應(yīng)用Mega5

5、.1軟件比對每個ST型別所對應(yīng)的7個等位基因的連鎖序列構(gòu)建最小進化(ME)樹，分析各菌株間的親緣關(guān)系;同時應(yīng)用START2軟件分析MLST數(shù)據(jù)，計算dN/dS率、關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)IsA、統(tǒng)計沉默核苷酸位點的數(shù)目等，以分析各位點核苷酸多樣性和基因重組的情況。
　　研究結(jié)果:
　　1.血清學(xué)分型:本研究共收集得到廣東省2007-2013年腹瀉病例副溶血弧菌分離株469株，分為7種O抗原血清型，16種K抗原血清型以及24種組合血清

6、型。其中優(yōu)勢血清型為O3∶K6型(330株，70.36％)，其次為O4∶K8型（54株，11.51％）和01∶KUT型（28株，5.97％）。在本研究中，K抗原不能分型的菌株有44株，而O抗原不能分型的有2株，還發(fā)現(xiàn)了較為特別的O1∶K36型菌株，在以往的研究中報道較少。
　　2.毒力基因攜帶情況:有95.74％(449/469)的副溶血弧菌分離株為tdh+trh-菌株，1.28％(6/469)為tdh-trh+菌株，3株為tdh

7、-trh-菌株，僅2株為tdh+trh+菌株。副溶血弧菌分離株中有64.39％(302/469)攜帶GS-PCR和/或orf8基因。值得注意的是，有8.61％(26/302)僅攜帶orf8基因，而有8.61％(26/302)僅攜帶GS-PCR基因，以上兩種菌株均缺失了其中一種標(biāo)識。
　　3.“大流行菌群”分布情況:根據(jù)副溶血弧菌“大流行菌群”的判定標(biāo)準(zhǔn)，共有63.75％(299/469)的菌株被判定為“大流行菌群”，包括7種血清型

8、:O3∶K6型、O4∶K8型、O1∶KUT型、O1∶K38型、O3∶K29型、O4∶K68型和O5∶K68型，其中，O3∶K6型的分離株最多。
　　4.MLST結(jié)果
　?、俚任换蛐图昂塑账岫鄳B(tài)性情況:7個管家基因的等位基因數(shù)從16(pntA)到20(gyrB)不等。各管家基因的核苷酸多態(tài)性位點數(shù)在23(dnaE)到161(recA)之間浮動。每個管家基因位點出現(xiàn)頻率最高的等位基因分別是:dnaE-3（96株），gyrB-4

9、（101株），recA-19（95株），dtdS-4（95株），pntA-29（94株），pyrC-4（94株）以及tnaA-22（95株）。在dnaE、recA、pntA、pyrC和tnaA四個基因中，dN/dS率（非同義變異與同義變異的比率），均小于1，而在gyrB和dtdS基因中值為0。7個管家基因的平均G+C含量在43.92％(pntA)到50.27％(dtdS)之間浮動，與副溶血弧菌本身的45.4％ G+C含量接近。
　

10、?、赟T型分布情況:150株副溶血弧菌分離株共被分為30個不同的ST型別，其中有3個ST型為首次發(fā)現(xiàn)，之前在數(shù)據(jù)庫中并未出現(xiàn)過，分別為:ST-1117、ST-1118和ST-1119型。21個ST型只有一株分離株，而剩下的7個ST型分別包括了2到89株不等的分離株。而本研究中出現(xiàn)頻率最高的ST型為ST-3型（89株，59.33％），主要由O3∶K6型菌株組成(79株，88.76％)。
　?、弁磸?fù)合體:通過eBURST軟件的分析，

11、30個ST型別被分為:1個同源復(fù)合體(Clonal Complex，CC) CC3，3個雙聯(lián)體(Doublets，D) D1、D2和D3，以及19個獨特型(Singletons，S)。CC3共包括95株分離株，涵蓋5個ST型(ST-3、ST-431、ST-661、ST-435和ST-787)，其中ST3型被定義為該同源復(fù)合體的始祖序列型(ancestral type or founder)。
　?、芗号c系統(tǒng)發(fā)育分析:ME進化樹(

12、minimum evolution tree)是由30個ST型的7個管家基因的串聯(lián)序列構(gòu)建而成。在本研究中，ME樹主要包括兩個部分，它們之間的遺傳關(guān)系較遠。eBURST與ME進化樹的分析結(jié)果基本一致，但雙聯(lián)體D1中的ST-189和ST-265由于其在recA位點上的差異，被分成了單獨的兩部分，還將一些獨特型分在了同一簇群中建立了進化關(guān)系。與eBURST相比，ME進化樹具有更好的分辨力，能夠揭示一些eBURST未能發(fā)現(xiàn)的群組或獨特型之間的

13、進化發(fā)育關(guān)系。
　?、莼蛑亟M情況:運用START2軟件，對7個管家基因的DNA序列進行分析，發(fā)現(xiàn)recA基因的沉默多態(tài)位點數(shù)目多達126個，顯著高于其他管家基因。在對7個管家基因進行連鎖平衡的分析時，得到的關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)IsA=0.9024(p＜0.05)，表明7個管基因之間存在顯著的連鎖不平衡現(xiàn)象。而排除“大流行菌群”分離株后，再次進行計算，得到的關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)IsA=0.8063(p＜0.05)，較150株的關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)化

14、指數(shù)有所下降。
　　研究結(jié)論:
　　1.廣東省2007-2013年間的腹瀉病例副溶血弧菌優(yōu)勢血清型為O3∶K6型，絕大部分腹瀉病例分離株為致病性副溶血弧菌。
　　2.廣東省2007-2013年間由副溶血弧菌“大流行菌群”感染所引起的腹瀉病例在副溶血弧菌感染中所占的比重超過50％，表明在廣東省，“大流行菌群”仍然為優(yōu)勢流行克隆群，因此要加強對“大流行菌群”生長環(huán)境及傳播途徑的研究，以便更好地應(yīng)對副溶血弧菌所引發(fā)的食源性疾