三種致病菌的多重PCR檢測及副溶血弧菌tdh基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、目前，微生物引起的食品安全問題受到世界各國的關(guān)注。副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和單細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）被認(rèn)為是三種重要的污染食品的致病菌，由這些菌引起的食物中毒事件近年來呈上升趨勢。通常，對(duì)這三種菌的傳統(tǒng)的檢測和鑒定方法依賴于分離培養(yǎng)和生化鑒定等，但這些方法煩瑣費(fèi)時(shí)、耗力，且特異性不強(qiáng)。因此，建立快速

2、、靈敏、特異性強(qiáng)的病原微生物檢測方法是食品安全的當(dāng)務(wù)之急。 近年來免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，為食源性致病菌的檢測提供了良好的技術(shù)平臺(tái)。本文綜述了免疫熒光抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)、免疫金技術(shù)、核酸探針、多重PCR、基因芯片、生物傳感器等方法，其中多重PCR因其具有高效性、特異性和簡便性，因而被選擇作為本研究的主要研究方法。 本研究內(nèi)容分兩部分，第一部分側(cè)重于三種食源性致病菌的多重PCR檢測。根據(jù)副溶血弧菌的耐熱直接溶血素基因

3、（tdh）、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因（nuc）和單核細(xì)胞增生李斯特菌的侵入關(guān)聯(lián)蛋白基因（iap）分別設(shè)計(jì)引物，經(jīng)驗(yàn)證表明三對(duì)引物的特異性良好，引物間不存在交叉。以三種菌的混合DNA為模板，使用每對(duì)引物進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，分別得到了相關(guān)的目的基因片段，經(jīng)克隆和序列分析，tdh、nuc和iap基因與GenBank中相關(guān)序列的同源性分別達(dá)到100％、100％和98％。在單重PCR條件的基礎(chǔ)上，建立了對(duì)三種菌的多重PCR檢測方法，并對(duì)Mg

4、2+濃度、dNTP濃度和延伸時(shí)間等反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：三對(duì)引物能特異性地?cái)U(kuò)增出202bp、484bp和714bp的目的片段。優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系為：10×PCR buffer（-Mg2+）2．5μL、200μmol/L dNTP、2mmol/L Mg2+、模板2μL、2．5U Taq酶，引物濃度分別為：副溶血弧菌200nmol/L、金黃色葡萄球菌40nmol/L、單核細(xì)胞增生李斯特菌320nmol/L，總反應(yīng)液2

5、5μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s、58℃退火40s、72℃延伸2min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸15min。為檢驗(yàn)該方法的實(shí)用性，對(duì)人工污染的貝類模擬樣品進(jìn)行了單重PCR和多重PCR檢測，結(jié)果顯示：單重PCR檢測限為：副溶血弧菌2．3CFU/mL、金黃色葡萄球菌2．5CFU/mL、單細(xì)胞增生李斯特氏菌1．5 CFU/mL；多重PCR的檢測限為副溶血弧菌2．3×102CFU/mL、金黃色葡萄球菌2．5×101C

6、FU/mL、單核細(xì)胞增生李斯特菌1．5×103CFU/mL。本研究通過多重PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌的一次性檢出，具有快速，靈敏度高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。 第二部分內(nèi)容為副溶血弧菌耐熱直接溶血素基因tdh的原核表達(dá)研究。通過PCR技術(shù)擴(kuò)增得到tdh全長基因，將其連接克隆載體pMD18-T后進(jìn)行測序分析，證實(shí)無點(diǎn)突變，且兩端成功引入限制性酶切位點(diǎn)。將表達(dá)載體pET-32a與tdh用EcoRⅠ和H