副溶血弧菌常規(guī)調(diào)查及其3種基因(tlh、tdh及trh)LAMP檢測(cè)方法的研究.pdf

1、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種重要的食源性致病菌，人們食用受該菌污染的食物后會(huì)引起腹瀉、嘔吐等癥狀，甚至導(dǎo)致脫水、休克及死亡。目前，副溶血弧菌引起食物中毒的發(fā)生規(guī)模呈明顯擴(kuò)大趨勢(shì)，已成為我國(guó)首要的食源性致病菌。因此，對(duì)副溶血弧菌進(jìn)行常規(guī)調(diào)查，了解其分布、形態(tài)和類型以及發(fā)展新型副溶血弧菌檢測(cè)方法就顯得尤為重要。當(dāng)前，雖然國(guó)內(nèi)外已有采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamp

2、lification，LAMP)檢測(cè)副溶血性弧菌的相關(guān)報(bào)道，但是仍存在成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、不穩(wěn)定和易污染等不足，因此迫切需要一種新型的檢測(cè)副溶血弧菌的方法。
　　 目的：了解市售水產(chǎn)品中副溶血弧菌污染情況并建立簡(jiǎn)便、快速和靈敏的新型LAMP檢測(cè)副溶血弧菌基因tlh，tdh和trh的方法。
　　 方法：一、在食物中毒高發(fā)季節(jié)采集魚、蝦、貝、蟹及頭足5類20種共161份樣本，然后按照傳統(tǒng)培養(yǎng)法和生理生化法進(jìn)行副溶血弧菌分離和鑒定

3、，之后采用普通PCR法檢測(cè)副溶血弧菌的tlh堪因進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)其毒力基因(tdh和trh)進(jìn)行檢測(cè)和分布統(tǒng)計(jì)分析，最后采用11種O群分群血清對(duì)分離到并驗(yàn)證的副溶血弧菌進(jìn)行血清分群研究。二、針對(duì)副溶血弧菌種特異性基因.不耐熱溶血毒素基因(砌)的6個(gè)特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)1套LAMP引物，通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系(鎂離子濃度、甜菜堿濃度、內(nèi)外引物比及環(huán)引物加入與否)及反應(yīng)條件(反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間)的優(yōu)化建立副溶血弧菌的LAMP檢測(cè)法，之后通過(guò)采用LAMP法檢

4、測(cè)74株實(shí)驗(yàn)菌評(píng)價(jià)其特異性，通過(guò)采用LAMP法檢測(cè)梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)菌基因組DNA、純培養(yǎng)的副溶血弧菌及貝類模擬樣本評(píng)價(jià)其檢測(cè)敏感性，并與普通PCR法檢測(cè)敏感性對(duì)比分析評(píng)價(jià)其應(yīng)用價(jià)值。三、針對(duì)副溶血弧菌種特異性基因-溶血毒素基因(tdh及trh)的6個(gè)特異性位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)1套LAMP引物，采用新建的LAMP法體系和條件對(duì)74株食源性病原菌分別進(jìn)行tdh和tlh基因的LAMP檢測(cè)，觀察其檢測(cè)特異性并評(píng)價(jià)該方法的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。
　　 結(jié)果

5、：一、通過(guò)傳統(tǒng)方法分離和鑒定及PCR驗(yàn)證，161份樣本中共檢出副溶血弧菌45株，平均檢出率為27.95％，不同種類水產(chǎn)品中Vp的檢出率有顯著性差異(x2=11.20，0.01

6、5)、O：10群占8.9％(4/45)、O：11群占26.7％(12/45)。二、反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化表明，tlh基因的LAMP檢測(cè)在8mM鎂離子、0M甜菜堿、8:1的內(nèi)外引物比、加入40mM環(huán)引物的反應(yīng)體系，60℃反應(yīng)55分鐘即可完成；該方法檢測(cè)74株實(shí)驗(yàn)菌中副溶血弧菌均陽(yáng)性，其它菌和空白對(duì)照都陰性；該方法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌基因組DNA最低檢測(cè)限可達(dá)到1fg，檢測(cè)純培養(yǎng)物最低檢測(cè)限為2.53×102CFU/mL(較普通PCR高1000倍)，檢

7、測(cè)貝類模擬樣本最低檢測(cè)限為9.42×102CFU/g(較普通PCR高1000倍)。三、tdh的LAMP檢測(cè)法檢測(cè)74株食源性病原菌中，7株含tdh基因的副溶血弧菌均為陽(yáng)性，其余均為陰性；trh基因的LAMP檢測(cè)法檢測(cè)74株食源性病原菌中，1株含trh基因的副溶血弧菌為陽(yáng)性，其余均為陰性。
　　 結(jié)論：本研究副溶血弧菌常規(guī)調(diào)查對(duì)上海市市售水產(chǎn)品中副溶血弧菌的分布情況提供了部分參考依據(jù)，同時(shí)本研究建立的以tlh、tdh和trh基因?yàn)?/p>