谷胱甘肽對乳酸菌脅迫抗性的調(diào)控機制研究.pdf

1、谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一種重要的非蛋白巰基化合物，具有清除自由基、解毒、增強免疫力等功能。目前，GSH已經(jīng)被作為重要的功能因子，廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)等領(lǐng)域。本論文以食品發(fā)酵生產(chǎn)中的重要菌株舊金山乳桿菌DSM20451T、乳酸乳球菌SK11和代謝工程研究中重要的基因工程宿主菌乳酸乳球菌NZ9000為實驗菌株，以研究冷凍脅迫和酸脅迫狀態(tài)下GSH對乳酸菌的生理調(diào)控方式為目標(biāo)，詳細闡述了冷凍脅迫和酸脅迫下乳酸菌細胞的生理狀態(tài)

2、以及GSH對乳酸菌生理活性和結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響，并對其作用機理進行了較為深入的探討。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.舊金山乳桿菌DSM20451T自身不能合成GSH，但具有從外界吸收GSH的能力，并且細胞內(nèi)GSH的積累隨外源添加量和添加時間的增加而增加。在MRS培養(yǎng)基中，當(dāng)外源GSH添加量為4.8 mmol·L-1時，舊金山乳桿菌DSM20451T細胞內(nèi)的GSH濃度為20.03±0，07(nmol·mg protein-1)，此時細胞

3、對GSH的吸收趨于飽和。
　　 2.GSH對前培養(yǎng)至穩(wěn)定中后期(36h)的舊金山乳桿菌DSM20451T細胞的抗冷凍保護作用最為顯著，在4℃和-20℃下脅迫30 d后，舊金山乳桿菌DSM20451T(GSH+)細胞的存活率分別是(GSH-)細胞的8.43倍和6.40倍；經(jīng)過4℃和-20℃冷凍脅迫15 d后，在重培養(yǎng)過程中DSM20451T(GSH+)細胞比DSM20451T(GSH-)細胞的生長延滯期分別縮短了13.5 h和12

4、 h。
　　 3.GSH不影響正常環(huán)境下舊金山乳桿菌DSM20451T細胞的生長和代謝活性；在冷凍脅迫條件下，GSH緩解了代謝關(guān)鍵酶(3-磷酸甘油醛脫氫酶，GAPDH；丙酮酸激酶，PK；乳酸脫氫酶，LDH)活性的下降；同時，冷凍脅迫過程中的DSM20451T(GSH+)保持了較高的胞內(nèi)ATP水平，-20℃脅迫20 d后，舊金山乳桿菌DSM20451T(GSH+)和(GSH-)的胞內(nèi)ATP濃度分別為脅迫處理前的6.4%和1.9%。

5、同時，作為影響細胞存活率重要因素的胞內(nèi)pH(pHi)在冷凍脅迫下的舊金山乳桿菌DSM20451T(GSH-)細胞內(nèi)顯著降低，而舊金山乳桿菌DSM20451T(GSH+)細胞的pHi在該過程中始終高于脅迫前的初始值。上述結(jié)果表明GSH對冷凍脅迫下細胞代謝活性、能量水平和pHi動態(tài)平衡的調(diào)節(jié)對提高舊金山乳桿菌DSM20451T細胞冷凍脅迫抗性具有重要意義。在重培養(yǎng)過程中的生長延滯期內(nèi)，舊金山乳桿菌DSM20451T(GSH-)細胞的代謝關(guān)鍵

6、酶活性無顯著變化，而舊金山乳桿菌DSM20451T(GSH+)細胞的PK和GAPDH活性分別增至重培養(yǎng)初始值的3.17倍和1.66倍。同時，冷凍脅迫過程中減少的胞內(nèi)GSH濃度在重培養(yǎng)過程中也呈現(xiàn)出上升趨勢，重培養(yǎng)18 h后胞內(nèi)GSH濃度為冷凍脅迫處理前的78.8%。從細胞內(nèi)GSH濃度與上述酶的活性變化關(guān)系，推測GSH在冷凍過程中對代謝關(guān)鍵酶的保護與“硫醇化”作用有關(guān)。
　　 4.在冷凍脅迫過程中，GSH能夠顯著保護舊金山乳桿菌D

7、SM20451T細胞的細胞膜完整性和平滑度并提高細胞膜不飽和脂肪酸成分的比例。冷凍脅迫處理前，舊金山乳桿菌DSM20451T(GSH+)與(GSH-)細胞膜具有相似的不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比值(U/S值)，然而隨著4℃下冷凍脅迫的進行，舊金山乳桿菌DSM20451T(GSH+)與(GSH-)的U/S值差距逐漸增大，脅迫14 d后DSM20451T(GSH+)的U/S值是(GSH-)的2.44倍。
　　 5.冷凍脅迫下GSH對舊

8、金山乳桿菌DSM20451T細胞膜的保護作用與防止細胞膜脂質(zhì)的氧化和對細胞膜上某些關(guān)鍵酶的保護作用有關(guān)。在冷凍脅迫過程中，舊金山乳桿菌細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)發(fā)生了顯著的變化：[NAD+]/[NADH]比值持續(xù)上升，SOD活性和胞內(nèi)巰基水平(包括蛋白巰基和非蛋白巰基)下降，上述結(jié)果表明冷凍脅迫誘發(fā)了細胞內(nèi)氧脅迫的產(chǎn)生。在該過程中，GSH阻止了細胞膜不飽和脂肪酸(如亞油酸)的氧化，對維持細胞膜的流動性發(fā)揮了重要作用。此外，控制細胞膜滲透性和質(zhì)

9、子梯度的關(guān)鍵膜蛋白Na+，K+-ATPase在舊金山乳桿菌DSM20451T(GSH-)細胞內(nèi)活性迅速下降，而(GSH+)細胞內(nèi)的Na+，K+-ATPase活性在4℃和-20℃冷凍脅迫30 d后，仍然保持了脅迫前初始值的75.8%和82.1%，表明冷凍脅迫下GSH對Na+，K+-ATPase具有顯著的保護作用。
　　 6.通過二維電泳和飛行質(zhì)譜技術(shù)對冷凍脅迫前后細胞的蛋白質(zhì)差異點進行分析得知，GSH對正常生長條件下細胞的生理狀態(tài)

10、沒有構(gòu)成顯著影響；冷凍脅迫處理后舊金山乳桿菌DSM20451T(GSH+)和(GSH-)的蛋白點總數(shù)和差異點均高于冷凍脅迫前的同類型樣本，表明冷凍脅迫使細胞的蛋白表達發(fā)生了一定的變化。進一步的研究證實，GSH通過在蛋白質(zhì)水平調(diào)控與細胞代謝活性相關(guān)的酶類(如β-葡萄糖磷酸變位酶和磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶)、脅迫應(yīng)激蛋白(如UspA、β-葡萄糖磷酸變位酶和磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶)、氧化還原酶(如谷胱甘肽過氧化物酶)以及與DNA復(fù)制、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄、翻譯相關(guān)的

11、酶增強了舊金山乳桿菌DSM20451T細胞的冷凍脅迫抗性。
　　 7.GSH具有保護舊金山乳桿菌DSM20451T、乳酸乳球菌SK11和乳酸乳球菌NZ9000抵抗酸脅迫的作用，其作用效果對前培養(yǎng)至穩(wěn)定后期的細胞最為顯著。pH4.0脅迫10 h后舊金山乳桿菌DSM20451T(GSH+)、SK11(GSH+)和NZ9000(pNZ3203)細胞的存活率分別是對照菌的6.14倍、15.9倍和18.0倍；pH2.5脅迫30 min后S

12、K11(GSH+)和NZ9000(pNZ3203)細胞的存活率分別為對照細胞的17.2倍和15.0倍。GSH提高細胞酸脅迫抗性的作用機制主要通過緩解胞內(nèi)pH下降和保護代謝關(guān)鍵酶3-磷酸甘油醛脫氫酶實現(xiàn)。此外，外源GSH與細胞自身合成的GSH存在著作用方式上的差異，在酸脅迫過程中，SK11(GSH+)胞內(nèi)的GSH被大量消耗，pH4.0脅迫4h后殘余的胞內(nèi)GSH僅為初始值的7.6%，即外源GSH主要以“自殺式”消耗方式發(fā)揮其酸脅迫下的保護作