乳酸菌中隱蔽質(zhì)粒的研究.pdf

1、乳酸菌在自然界分布廣泛，其中比較有代表性的菌屬為乳桿菌屬、乳球菌屬、片球菌屬和明串珠球菌屬。很早以前，人們就利用發(fā)酵乳酸菌來(lái)制作不同風(fēng)味的食品。在所有乳制品的加工和制作過(guò)程中，乳酸菌的發(fā)酵發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。某些野生型的乳酸菌菌株作為益生菌，同時(shí)又是細(xì)菌素的生產(chǎn)者，在生物技術(shù)研究方面前景遠(yuǎn)大，它們?cè)谛屡d的功能性食品的發(fā)展上有潛在的用途。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)乳酸菌許多重要的生理功能都直接或間接地與其攜帶的質(zhì)粒有關(guān)。所以，乳酸菌質(zhì)粒的

2、研究對(duì)于篩選新的優(yōu)良菌種，改良現(xiàn)有的生產(chǎn)菌種，組建食品級(jí)載體受體系統(tǒng)，建立乳酸菌體內(nèi)分子克隆體系都具有重大意義。雖然通過(guò)基因工程技術(shù)我們可以對(duì)食品和藥品工業(yè)產(chǎn)生很多正面的影響，但這一趨勢(shì)在國(guó)外卻被圍繞這種技術(shù)產(chǎn)生的相關(guān)法律所阻擋。所以乳酸菌的基因調(diào)整，需要食品級(jí)別的發(fā)展，它的分子克隆系統(tǒng)只允許來(lái)自自體移植物或GRAS生物體并且無(wú)抗生素標(biāo)記。但是考慮到質(zhì)粒的遷移性，防止功能性質(zhì)粒遷移到腸道中其他有害菌中，提高有害菌群的抗性，所以對(duì)功能性質(zhì)

3、粒的食品級(jí)別使用還是要慎重，為了使質(zhì)粒能夠在宿主菌內(nèi)穩(wěn)定遺傳，應(yīng)該選用theta式復(fù)制的隱蔽質(zhì)粒。 本研究在對(duì)多株乳酸菌進(jìn)行破壁處理后使用Takara質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，對(duì)質(zhì)粒電泳分析，選定的質(zhì)粒供體菌，對(duì)質(zhì)粒供體菌進(jìn)行特性分析，并根據(jù)基因工程載體特性和隱蔽質(zhì)粒的特點(diǎn)選擇一個(gè)合適的隱蔽質(zhì)粒，然后用Southern分子雜交試驗(yàn)分析該隱蔽質(zhì)粒的復(fù)制方式，檢驗(yàn)是否合適作為載體。具體實(shí)驗(yàn)方法：細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取，質(zhì)粒DNA的電

4、泳分析，質(zhì)粒DNA電泳帶的回收，目標(biāo)質(zhì)粒DNA的酶切，以及Southern分子雜交試驗(yàn)。 在把21株乳酸菌破壁處理后采用Takara質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行乳酸菌質(zhì)粒DNA的提取，得到的質(zhì)粒進(jìn)行分析比較，選定包含質(zhì)粒比較多的菌株L12作為隱蔽質(zhì)粒的供體菌進(jìn)行特性分析。在對(duì)L12中質(zhì)粒比較后，選擇質(zhì)粒pBL102作為目標(biāo)質(zhì)粒，用Kpn I、EcoR I、Pst I、BamH I、Sac I五種酶對(duì)質(zhì)粒pBL102酶切分析并繪制大概的酶切