植物乳桿菌P-8lai同源重組敲除載體的構(gòu)建及電轉(zhuǎn)化條件的研究.pdf

1、共軛亞油酸(Conjugated linileic acid，CLA)是目前公認(rèn)的具有抗氧化、抗癌、減肥降脂、調(diào)節(jié)免疫力等多種生理功能的健康營養(yǎng)品，已廣泛應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥等多個領(lǐng)域，目前已成為研究的熱點。許多微生物體內(nèi)都含有亞油酸異構(gòu)酶(linoleicacid isomerase，LAI)，它可將亞油酸(linoleic acid，LA)催化生成CLA，其中，植物乳桿菌和德式乳桿菌的轉(zhuǎn)化效率最高。植物乳桿菌P-8是源自內(nèi)蒙古烏拉

2、特中旗的優(yōu)良發(fā)酵菌種，經(jīng)研究表明該菌具有降血脂和改善胃腸道微生物群落結(jié)構(gòu)等特性，并且可高效產(chǎn)生CLA。因此，對植物乳桿菌P-8亞油酸異構(gòu)酶基因結(jié)構(gòu)的研究與改造具有重要的理論和實用價值。
　　基因敲除技術(shù)是研究基因功能的方法之一，能精確定點的修飾和改造目的基因，而且經(jīng)改造的基因片段能隨著基因組的復(fù)制而穩(wěn)定遺傳，目前已廣泛應(yīng)用于各類生物的研究。
　　文章利用同源重組基因敲除技術(shù)原理，構(gòu)建了植物乳桿菌P-8 lai的敲除載體，并對

3、外源質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化植物乳桿菌P-8的條件進(jìn)行研究，為lai的敲除奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)GenBank中注冊登記的lai序列，設(shè)計合成多對引物，經(jīng)過多次PCR擴(kuò)增得到lai-up和lai-down兩同源臂片段，并成功克隆到pMD19-T載體上。將擴(kuò)增得到的kan抗性基因也構(gòu)建到pMD19-T載體上。利用限制性內(nèi)切酶將lai-up、lai-down和kan分別從pMD19-T載體上切下并成功構(gòu)建到pUC18載體上，最終得到的同源重組敲除載體，命名為p