瑞香素對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞促凋亡基因去甲基化作用及分子機(jī)制.pdf

1、目的:
　　探討瑞香素對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞促凋亡基因去甲基化作用及分子機(jī)制，進(jìn)一步探索瑞香素治療RA的可能機(jī)制，為瑞香素的藥用開(kāi)發(fā)和RA的治療思路提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)CIA大鼠滑膜細(xì)胞;
　　2.MTT法檢測(cè)不同濃度瑞香素及5-aza-Dc對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞作用不同時(shí)間后對(duì)其增殖的影響;
　　3.瑞香素對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞促凋亡基因去甲基化作用及分子機(jī)制:實(shí)驗(yàn)分組:①CIA大鼠滑

2、膜細(xì)胞未處理組（對(duì)照組）;②陽(yáng)性去甲基化試劑5-aza-Dc（20μM）處理組(5-aza-Dc組);③瑞香素（40μg/mL）處理組（瑞香素組）;④瑞香素(40μg/mL)聯(lián)合5-aza-Dc(20μM)處理組（聯(lián)合組）。CIA大鼠滑膜細(xì)胞按上述實(shí)驗(yàn)分組，經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)72h后收集細(xì)胞，檢測(cè)如下指標(biāo):(1)甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR，MSP)檢測(cè)促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL及p53甲基化狀態(tài)

3、;(2)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(real-timefluorescencequantitativePCR)檢測(cè)CIA大鼠滑膜細(xì)胞促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL、p53及甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3bmRNA表達(dá);(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL及p53蛋白表達(dá);(4)PI染色熒光顯微鏡觀察滑膜細(xì)胞凋亡情況;(5)AnnexinV/PI雙染流式法檢測(cè)滑膜細(xì)胞的凋亡率;(6)掃描和透射

4、電鏡法觀察CIA大鼠滑膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　結(jié)果:
　　1.①瑞香素濃度（μg/mL）為40、20、10、5、2.5、1.25時(shí)，分別作用CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞72h、60h、48h、36h后，抑制率(％)分別為:82.80±0.85、80.20±1.41、59.70±1.13、49.35±1.34;57.50±1.27、53.15±3.18、42.75±3.89、34.00±5.37;43.75±4.74、37.15

5、±4.45、35.05±3.32、29.55±1.63;40.50±3.82、35.90±5.09、33.90±4.95、28.70±0.34;37.40±4.53、34.25±5.73、27.85±1.48、23.15±3.18;33.25±3.46、26.50±1.98、25.65±0.42、19.50±1.13;②5-aza-Dc濃度(μM)為20、10、5、2.5、1.25時(shí)，分別作用于CIA大鼠滑膜細(xì)胞72h、60h、48h、

6、36h后，抑制率(％)分別為:84.30±1.56、82.90±3.39、72.10±1.84、32.35±2.62;57.35±4.31、46.15±3.89、34.15±3.18、25.75±4.17;53.65±1.20、45.40±3.68、23.65±0.70、20.25±0.07;49.30±1.27、39.90±1.27、17.35±1.48、13.65±1.20;30.95±2.19、24.41±2.68、13.23±0

7、.53、9.19±1.17。
　　2.MSP結(jié)果顯示CIA大鼠滑膜細(xì)胞對(duì)照組中促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL及p53甲基化引物和非甲基化引物均擴(kuò)增出特異性條帶。基因DR3、PDCD5、FasL和p53經(jīng)瑞香素和5-aza-Dc處理后甲基化擴(kuò)增條帶亮度均有所降低，相應(yīng)的非甲基化擴(kuò)增條帶亮度均有所增強(qiáng)。聯(lián)合組可見(jiàn)促凋亡基因DR3、FasL、PDCD5及p53甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物條帶較CIA大鼠滑膜細(xì)胞對(duì)照組和瑞香素、5-aza-Dc

8、單獨(dú)處理組亮度均降低，相應(yīng)的非甲基化條帶亮度增強(qiáng);其中PDCD5甲基化引物不能擴(kuò)增出甲基化特異性條帶，而非甲基化引物可以擴(kuò)增出特異性條帶，呈現(xiàn)完全非甲基化狀態(tài)。
　　3.RT-PCR結(jié)果顯示瑞香素組、5-aza-Dc組及聯(lián)合組DR3、PDCD5、FasL、p53mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);瑞香素、5-aza-Dc組及聯(lián)合組甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3bmRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.

9、05）。瑞香素組中促凋亡基因中除FasL外，DR3、PDCD5和p53mRNA表達(dá)水平均明顯高于5-aza-Dc組;甲基化轉(zhuǎn)移酶中除DNMT1外，DNMT3a和DNMT3bmRNA表達(dá)水平均明顯低于5-aza-Dc組(P＜D.05)。聯(lián)合組中DR3、PDCD5、FasL和p53mRNA表達(dá)水平明顯高于瑞香素組和5-aza-Dc單獨(dú)處理組;甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3bmRNA達(dá)水平均顯著低于瑞香素組和5-aza-Dc

10、組（P＜0.05）。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示瑞香素、5-aza-Dc組和聯(lián)合組CIA大鼠滑膜細(xì)胞促凋亡蛋白DR3、PDCD5、FasL和p53陽(yáng)性細(xì)胞百分率均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);瑞香素組除FasL外，DR3、PDCD5和p53陽(yáng)性細(xì)胞百分率均顯著高于5-aza-Dc組（P＜0.05）;聯(lián)合組促凋亡蛋白DR3、PDCD5、FasL和p53陽(yáng)性細(xì)胞百分率均顯著高于瑞香素組和5-aza-Dc組(P＜0.05)。
　

11、　5.PI染色后熒光顯微鏡下觀察到:CIA大鼠滑膜細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞呈極少量的強(qiáng)紅色熒光和微弱紅色熒光;5-aza-Dc組滑膜細(xì)胞微弱紅色和較強(qiáng)紅色熒光較對(duì)照組增加;瑞香素組滑膜細(xì)胞微弱和較強(qiáng)紅色熒光均較前兩組有所增加;聯(lián)合組滑膜細(xì)胞則大部分呈微弱和較強(qiáng)紅色熒光。
　　6.AnnexinV/PI雙染流式法顯示瑞香素組、5-aza-Dc和聯(lián)合組CIA大鼠滑膜細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡率均顯著高于CIA大鼠對(duì)照組(P＜0.05);聯(lián)合組滑膜細(xì)

12、胞凋亡率顯著高于瑞香素組和5-aza-Dc組(P＜0.05)。
　　7.掃描電鏡觀察對(duì)照組CIA大鼠滑膜細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞呈圓形或橢圓形，表面有豐富細(xì)密的微絨毛狀突起;5-aza-Dc組可見(jiàn)細(xì)胞稍有形變，表面微絨毛減少;而瑞香素組較對(duì)照組變形嚴(yán)重，外觀呈不規(guī)則狀，細(xì)胞表面微絨毛狀突起消失，主要變現(xiàn)為小泡狀和指狀突起;聯(lián)合組滑膜細(xì)胞極度變形，細(xì)胞表面變得極為光滑，細(xì)胞表面局部已嚴(yán)重破裂。
　　8.透射電鏡顯示對(duì)照組CIA大鼠滑膜細(xì)胞

13、可見(jiàn)細(xì)胞表面絨毛、核膜結(jié)構(gòu)清晰，核漿比大，核異型性明顯，核仁清晰，胞漿內(nèi)細(xì)胞器發(fā)育良好;5-aza-Dc組表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小，形態(tài)不規(guī)則，表面微絨毛消失，雙層核膜清晰，核固縮，染色質(zhì)邊聚，胞質(zhì)內(nèi)有少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體，線粒體腫脹并發(fā)生空泡變性，游離核糖體發(fā)達(dá)，呈凋亡改變;瑞香素組較5-aza-Dc組染色質(zhì)發(fā)生濃聚，凋亡進(jìn)一步發(fā)展;聯(lián)合組滑膜細(xì)胞明顯可見(jiàn)核膜消失，凋亡小體形成。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)屬于原創(chuàng)性研究，首次探討

14、了金邊瑞香活性成份瑞香素對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞促凋亡基因去甲基化作用及分子機(jī)制。
　　1.瑞香素在1.25μg/mL～40μg/mL范圍內(nèi)對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用，且呈現(xiàn)良好的劑量依賴性。
　　2.瑞香素對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL及p53啟動(dòng)子區(qū)具有一定的去甲基化作用。
　　3.瑞香素可協(xié)同5-aza-Dc使CIA大鼠滑膜細(xì)胞促凋亡基因DR3、PDCD5、FasL及p