TNF-α對(duì)急性肝衰竭大鼠發(fā)生腸道細(xì)菌移位時(shí)腸粘膜Claudin-1、ZO-1和MLCK表達(dá)的影響及TNF-α拮抗劑的干預(yù)效果.pdf

1、目的：
　　研究腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）對(duì)急性肝衰竭（Acute liver failure,ALF）大鼠發(fā)生腸道細(xì)菌移位時(shí)腸粘膜Claudin-1、ZO-1蛋白和肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)表達(dá)的影響及TNF-α拮抗劑干預(yù)效果。
　　方法：
　　健康雄性SD大鼠54只，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成3組，正常對(duì)照組6只腹

2、腔注射0.9％生理鹽水12ml/kg；模型組、干預(yù)組各24只，均給予腹腔注射D-氨基半乳糖(D-GalN)1200 mg/kg建立急性肝衰竭模型，干預(yù)組在給予D-氨基半乳糖24小時(shí)前給予腹腔注射TNF-α拮抗劑（rhTNFR:Fc益賽普）12.5mg/kg。模型組與干預(yù)組于腹腔注射D-氨基半乳糖后8、24、48、72h各處死6只動(dòng)物，正常對(duì)照組于72h同時(shí)處死動(dòng)物，進(jìn)行以下指標(biāo)檢測(cè)：①取各組肝、脾和腸系膜淋巴結(jié)組織勻漿進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)；②應(yīng)

3、用生化學(xué)方法檢測(cè)血清ALT、AST、Tbil、Alb水平；③酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)方法檢測(cè)血清TNF-α的水平；④肝組織和末段回腸組織經(jīng)HE染色后光鏡下觀察病理變化；⑤免疫組化和Western blot檢測(cè)各組末段回腸Claudin-1、ZO-1蛋白和MLCK的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、模型組與干預(yù)組ALT、AST逐漸升高，均于48h達(dá)到高峰，但干預(yù)組高峰較模型組高峰明顯降低；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，模型組與干預(yù)組出現(xiàn)總膽紅

4、素升高，但模型組的總膽紅素升高速度比干預(yù)組明顯快；模型組72h轉(zhuǎn)氨酶開(kāi)始出現(xiàn)下降時(shí)，總膽紅素繼續(xù)上升，出現(xiàn)膽酶分離現(xiàn)象，而干預(yù)組72h總膽紅素出現(xiàn)下降。急性肝衰竭模型組72h肝臟組織呈大片融合壞死，超過(guò)整個(gè)切片面積的2/3，肝臟組織的正常結(jié)構(gòu)消失，僅殘留少量肝細(xì)胞，肝竇出血、充血明顯，在壞死區(qū)及匯管區(qū)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，符合急性肝衰竭病理改變，急性肝衰竭模型誘導(dǎo)成功；干預(yù)組72h肝臟組織可見(jiàn)部分肝細(xì)胞水腫、點(diǎn)狀壞死，少量炎性細(xì)胞呈散在

5、性浸潤(rùn)于肝小葉內(nèi)和匯管區(qū)；在光鏡下模型組72h末段回腸可見(jiàn)絨毛伏倒，部分絨毛尖端脫落，絨毛黏膜和黏膜下層間質(zhì)水腫，黏膜層可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。干預(yù)組72h末段回腸結(jié)完整，未見(jiàn)粘膜上皮細(xì)胞脫落壞死情況，絨毛黏膜和黏膜下層間質(zhì)輕度水腫，黏膜層可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　2、正常對(duì)照組、模型組8h和干預(yù)組8h均未出現(xiàn)臟器細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性，模型組24h、48h和72h臟器細(xì)菌移位率分別為11.1%、38.89%和66.67%，干預(yù)組24h

6、、48h和72h臟器細(xì)菌移位率分別為5.56%、16.67%和27.78%。對(duì)照組與模型組、對(duì)照組與干預(yù)組24h、48h和72h之間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均P<0.05；干預(yù)組和模型組兩組24h、48h和72h之間的比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均P<0.05。
　　3、模型組大鼠8h的TNF-α含量為（117.89±13.09pg/ml），24h上升至高峰（239.83±15.81pg/ml），隨后開(kāi)始下降，48h、72h分別降

7、低至（149.37±20.86pg/ml、96.41±4.21pg/ml），與正常對(duì)照組（24.19±3.57pg/ml）比較差異均有顯著性差異（P<0.01）；而干預(yù)組大鼠的血清TNF-α含量于8h（52.06±18.06pg/ml）逐漸升高，于24h達(dá)到高峰（182.71±17.08pg/ml），48h開(kāi)始下降至（71.78±20.15pg/ml），72h進(jìn)一步下降為（57.22±7.39pg/ml），與正常對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、意義（干預(yù)組8h、48h與正常對(duì)照組的P<0.05，24h、72h的P<0.01），且與模型組各時(shí)間點(diǎn)TNF-α含量比較差異均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　4、western blot測(cè)定相對(duì)蛋白含量，模型組8h Claudin-1蛋白水平為0.9932±0.1849，與正常對(duì)照組1.640±0.1879的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.908，p<0.01），逐漸下降，24h降至最低0.3546±0.068，明顯低于對(duì)照組

9、（t=12.87，p<0.01），72h為0.8322±0.1169，低于對(duì)照組（t=7.301，p<0.01）；干預(yù)組8h Claudin1蛋白為1.387±0.2163，與對(duì)照組相比無(wú)差異（t=1.770，p>0.05），但與模型組8h比較稍高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)（t=2.765，p<0.05）；24h驟降至1.051±0.3702，明顯低于對(duì)照組（t=2.838，p<0.05），而高于模型組24h（t=3.700，p<0.05）；72h

10、為1.18103±0.1501，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.818，p<0.01），高于模型組72h（t=3.668，p<0.05）。模型組8h ZO-1蛋白水平為0.7256±0.09153，與正常對(duì)照組的1.015±0.1503差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.293，p<0.05），逐漸下降，24h降至最低0.3874±0.09148，明顯低于對(duì)照組（t=7.137，p<0.01），72h為0.5867±0.1780，明顯低于對(duì)

11、照組（t=4.534，p<0.01）；干預(yù)組8h ZO-1蛋白為0.8179±0.1190，與對(duì)照組相比無(wú)差異（t=2.060，p>0.05），與模型組8h比較稍高，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)（t=1.229，p>0.05），24h驟降至0.6423±0.08182，明顯低于對(duì)照組（t=4.36，p<0.05），而高于模型組24h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.153，p<0.01），72h為0.7622±0.09943，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

12、t=2.653，p<0.05），仍高于模型組72h（t=2.824，p<0.05）。模型組8h MLCK蛋白水平為0.6959±0.1295，與正常對(duì)照組的0.4597±0.06882差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.221，p<0.05），逐漸升高，24h升至高峰1.298±0.1935，明顯高于對(duì)照組（t=8.164，p<0.01），72h為0.9255±0.1575，高于對(duì)照組（t=5.420，p<0.01）；干預(yù)組8h MLCK蛋白為0

13、.5716±0.1566，與對(duì)照組相比無(wú)差異（t=1.308，p>0.05），與模型組8h比較稍低，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)（t=1.224，p>0.05），隨后逐漸升高，24h為1.033±0.07282，明顯高于對(duì)照組（t=11.44，p<0.01），但低于模型組24h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.564，p<0.05），72h恢復(fù)至0.6338±0.09899，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.889，p=0.0277，p<0.05），低

14、于模型組72h，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.136，p<0.05）。免疫組化結(jié)果顯示正常對(duì)照組的Claudin-1和ZO-1蛋白定位在細(xì)胞膜頂端，大量棕褐色染色信號(hào)陽(yáng)性，MLCK蛋白在胞漿中可見(jiàn)棕褐色染色信號(hào)。模型組72h的Claudin-1和ZO-1蛋白在細(xì)胞膜頂端表現(xiàn)為棕褐色信號(hào)減弱，呈鋸齒狀分布并有中斷現(xiàn)象，但MLCK蛋白的棕褐色染色信號(hào)呈強(qiáng)陽(yáng)性。Claudin-1蛋白在干預(yù)組72h回腸組織內(nèi)陽(yáng)性信號(hào)稍有減弱，與正常對(duì)照組比較陽(yáng)性染

15、色信號(hào)有所下降，但與模型組比較陽(yáng)性信號(hào)明顯增強(qiáng)；ZO-1蛋白在干預(yù)組72h回腸組織內(nèi)可見(jiàn)棕褐色陽(yáng)性染色信號(hào)，與正常對(duì)照組比較有所減弱，但與模型組比較有增強(qiáng)變化；MLCK蛋白在干預(yù)組72h回腸腸粘膜上皮細(xì)胞胞漿中強(qiáng)陽(yáng)性染色信號(hào)，比正常對(duì)照組染色信號(hào)稍強(qiáng)，但比模型組72h染色信號(hào)減弱。
　　結(jié)論：
　　急性肝衰竭大鼠模型的血清TNF-α水平升高，TNF-α通過(guò)增加MLCK含量使得細(xì)胞收縮加劇及細(xì)胞間隙增大，同時(shí)TNF-α使Cla