急性肝衰竭大鼠腸道干預實驗對其細菌移位、TLR4及LPS的影響.pdf

1、目的：應用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記技術示蹤大鼠急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）時腸道細菌移位（bacterial translocation，BT）狀況，并用天然蒙脫石進行腸道干預，研究其對BT、血中脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）濃度及單核細胞表面Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）表達的影響。

2、r>　　方法：將50只糞便中不含有氨芐抗性細菌的SD大鼠隨機分為五組：正常對照組（A）、生理鹽水對照組（B）、肝衰竭模型組（C）、天然蒙脫石（思密達）預防組（D）和天然蒙脫石（思密達）治療組（E）。A組不加干預，后四組大鼠灌飼增強綠色熒光蛋白（enchanced green fluorescent protein，EGFP）標記的大腸桿菌JM109進行示蹤，后三組大鼠用D-氨基半乳糖（D-GalN）一次性腹腔注射制備大鼠急性肝衰竭模型，

3、B組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水。D組大鼠在造模前連續(xù)三天灌飼思密達溶液，E組大鼠在造模后連續(xù)三天灌飼思密達溶液（0.12g/次，2次/天）。應用瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis，AGE）和激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal microscope，LSCM）鑒定內臟分離出的細菌是否來源于腸道；采用雙色熒光染色法，熒光素標記的抗TLR4/抗CD14對大鼠血液單核細胞表面

4、TLR4及CD14分子進行免疫熒光染色，進行流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測；采用PE標記的抗大鼠巨噬細胞抗體，檢測組織中巨噬細胞內GFP的平均熒光強度；檢測肝功能和血中LPS濃度。采用SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析。計量資料統(tǒng)計學描述采用xs±。組間指標差別檢驗采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。若方差不齊，采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多

5、重檢驗校正采用Bonferroni校正。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：通過AGE，間接證實了ALF大鼠存在腸道BT；通過LSCM的觀察，直接證實了組織中的巨噬細胞吞噬了來自腸道的示蹤菌。大鼠肝功能指標及LPS檢測結果：與正常對照組比較，生理鹽水對照組大鼠肝功能各項指標及LPS的差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與正常對照組比較，模型組、思密達預防組和思密達治療組大鼠的丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminot

6、ransferase，ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TBiL）和LPS增高，血清白蛋白（serum albumin，Alb）下降，經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著性差異（P<0.05）。與模型組比較，思密達預防組和思密達治療組大鼠的ALT、AST、TBiL和LPS下降，Alb升高，經(jīng)統(tǒng)計學處理有顯著性差異（P<0.05）。思密達預防組和思密達治療

7、組大鼠比較，預防組大鼠的ALT、AST、TBiL和LPS更低，差異有顯著性（P<0.01），Alb的比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.112）。大鼠血液單核細胞表面TLR4的表達結果：正常對照組、生理鹽水對照組、模型組、思密達預防組和思密達治療組大鼠TLR4表達分別為328.79±31.3、347.83±29.9、554.49±40.7、478.24±31.5和522.06±29.1。正常對照組與生理鹽水對照組大鼠比較無顯著性差異（P=0.

8、20）；模型組、思密達預防組和思密達治療組與正常對照組大鼠比較，TLR4表達均顯著增高（P<0.001）；思密達預防組和思密達治療組與模型組大鼠比較，TLR4表達顯著降低（P<0.05）；思密達預防組和思密達治療組大鼠比較，TLR4表達更低（P=0.004）。各組織巨噬細胞內GFP的平均熒光強度檢測結果：正常對照組與生理鹽水對照組大鼠比較，各組織間無顯著性差異（P>0.05）；模型組、思密達預防組和思密達治療組與正常對照組大鼠比較，GF