加味茵陳蒿湯對(duì)急性肝損傷大鼠肝組織TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及Th1-Th2影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討以加味茵陳蒿湯為代表的基本治法—解毒利濕、養(yǎng)陰益氣法對(duì)D-氨基半乳糖所致的急性肝損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型肝組織TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及Th1/Th2的影響與作用機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用中醫(yī)藥防治急性肝損傷提供理論依據(jù)。
　　方法：選擇清潔級(jí)SD大鼠，雌性，72只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性組（復(fù)方甘草酸苷，商品名：美能）、中藥加味茵陳蒿湯低劑量組、加味茵陳蒿湯中劑量組和加味茵陳蒿湯高劑量組。所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)在室溫15-20℃

2、，相對(duì)濕度60-80％的實(shí)驗(yàn)室7天。7天后給模型組、西藥組、中藥組予一次性腹腔注射D-GalN600mg/kg以造成急性肝損傷模型，造模后除模型組外余各組立即給予藥物灌胃,每日兩次，其中陽(yáng)性（美能）組的日給藥量為15.75mg/kg/天,加味茵陳蒿湯低、中、高劑量組的日給藥量分別為：14.7g/kg，29.4g/kg，58.8g/kg,空白對(duì)照組予以0.9%的生理鹽水灌胃，灌藥體積為10ml/kg/次，一日兩次，共灌胃治療2天。在此期間

3、觀察動(dòng)物一般狀況、攝食及飲水等。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有大鼠股動(dòng)脈采血，取血漿測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase,ALT）天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase,AST）、總膽紅素（TBIL）；雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor alpha,TNF-α）、白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2, IL-2）、白細(xì)胞

4、介素-4（Interleukin-4, IL-4）、白細(xì)胞介素-10（Interleukin-10,IL-10）、γ干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）及巨噬細(xì)胞炎性蛋白2（Macrophage inflammatory protein2,MIP-2）含量；免疫組化法測(cè)髓樣分化因子-88（myeloid ddifferentiation factor88,MyD88)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6（tumor necrosis

5、 factor receptor-associated factor，TRAF6）、IκB蛋白-α（inhibitory of NF-κB，IkB-α）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase p38MAPK）、（Toll-like-receptor4、TLR4）等指標(biāo)的含量，處死動(dòng)物，取肝右葉作常規(guī)HE切片，光鏡下觀察其變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)肝組織TLR4mRNA（Toll-li

6、ke-receptor4）的轉(zhuǎn)錄水平，蛋白印跡（Western blot）法檢測(cè)肝組織TLR4的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　?。?）造模后48h，模型組大鼠ALT、AST及TB含量明顯升高，與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。陽(yáng)性（復(fù)方甘草酸苷）組，加味茵陳蒿湯低、中、高劑量組ALT、AST、TB均有所降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。
　?。?）造模后48h，模型組血漿TNF-α、MI

7、P-2、MyD88、TRAF6、IkB-α、p38MAPK含量明顯增高，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。陽(yáng)性（美能）組、加味茵陳蒿湯低、中、高劑量治療組血漿TNF-α、MyD88、TRAF6、IkB-α、p38MAPK均明顯降低，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。
　?。?）造模后48h，模型組血漿IL-2、IL-4、IFN-γ及IL-10含量均明顯增高，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0

8、.05）。陽(yáng)性（美能）組、加味茵陳蒿湯低、中、高劑量治療組血漿IL-2、IL-4、IFN-γ及IL-10含量明顯降低，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。
　?。?）TLR4mRNA檢測(cè)結(jié)果：模型組TLR4mRNA的表達(dá)明顯增高，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。陽(yáng)性（美能）組、加味茵陳蒿湯低、中、高劑量組TLR4mRNA表達(dá)明顯降低，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。
　　（5）

9、Western blot檢測(cè)TLR4結(jié)果：模型組TLR4的蛋白表達(dá)明顯增高，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。陽(yáng)性（美能）組、加味茵陳蒿湯低、中、高劑量組TLR4蛋白表達(dá)明顯降低，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。
　?。?）肝組織HE染色檢測(cè)結(jié)果顯示：正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，著色均勻，無(wú)腫脹、擠壓、脆裂，無(wú)細(xì)胞變性、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)破壞較明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)欠清，肝細(xì)胞索排

10、列紊亂，肝細(xì)胞變性、溶解壞死、肝匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，肝細(xì)胞呈彌漫性空泡樣變。加味茵陳蒿湯高劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)較模型組清楚，只有散在脂肪小滴浸潤(rùn)，肝細(xì)胞僅彌漫性輕度水腫。加味茵陳蒿湯中劑量組肝組織結(jié)構(gòu)較模型組尚清楚，肝細(xì)胞變性、壞死較模型組有明顯減輕。加味茵陳蒿湯低劑量組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)部分破壞，肝細(xì)胞變性、溶解壞死、炎性細(xì)胞潤(rùn)較模型組輕，呈中度彌漫性空泡樣變。陽(yáng)性組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分破壞，肝細(xì)胞變性、壞死、出血較模型組略有減輕。

11、　　結(jié)論：
　　1.加味茵陳蒿湯低、中、高劑量治療組均能顯著減輕D-氨基半乳糖所致大鼠的肝細(xì)胞損傷，降低血漿中ALT、AST、TB含量，具有較好的保肝降酶作用。同時(shí)在病理方面，均能顯著改善肝組織的病理變化，縮小病變的面積，減輕肝細(xì)胞的損傷程度。
　　2.加味茵陳蒿湯低、中、高劑量治療組均能顯著減輕D-氨基半乳糖所致大鼠的肝細(xì)胞損傷，通過(guò)調(diào)節(jié)Th1、Th2類細(xì)胞因子，糾正Th1/Th2的免疫失衡狀態(tài)，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)而起到保