乳酸鏈球菌素nisin前導(dǎo)肽酶NisP的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、Nisin是一種由乳酸乳球菌產(chǎn)生分泌的抗菌多肽，其分子內(nèi)部含有5個硫酯環(huán)，因而被稱為羊毛硫抗生素。Nisin能夠有效抑制多種革蘭氏陽性細(xì)菌，同時由于其對哺乳動物及人類均無毒害作用，因而長期在世界范圍內(nèi)被廣泛用作食品防腐劑。
　　NisP屬于絲氨酸蛋白酶中的枯草桿菌酶家族，其作為nisin的前導(dǎo)肽酶，通過切除nisin前體中的前導(dǎo)肽而在nisin的最終成熟中起重要作用。乳酸乳球菌LAC71中，nisP基因部分缺失后，表達(dá)功能失活的N

2、isP蛋白，導(dǎo)致攜帶有前導(dǎo)肽的未成熟nisin的產(chǎn)生。本文通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段，純化并結(jié)晶了硒代NisP蛋白催化結(jié)構(gòu)域部分，收集了其1.10(A)的衍射數(shù)據(jù)并解析了其高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)。
　　文章首先將NisP與其同源蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較，表明與其他枯草桿菌酶家族成員有較高的同源性，均具有保守的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，利用活性位點的絲氨酸殘基對蛋白質(zhì)中的肽鍵進(jìn)行親核攻擊而造成蛋白質(zhì)的水解。通過對催化三聯(lián)體中的His306和Ser512進(jìn)行突變

3、，證明這兩個氨基酸殘基在NisP催化活性中的重要作用。
　　不同于其他枯草桿菌酶家族成員，在解析的結(jié)構(gòu)中，除了包含NisP催化結(jié)構(gòu)域部分外，還結(jié)合有NisP自身C末端的一小段多肽序列。觀察后發(fā)現(xiàn)該多肽C末端殘基恰位于NisP催化活性位點，表明該多肽可能是由NisP切割產(chǎn)生。通過體外合成包含剪切位點在內(nèi)的熒光標(biāo)記多肽進(jìn)行酶活測試、Western blot實驗以及質(zhì)譜實驗分析，證實NisP具有識別其C末端序列并進(jìn)行剪切的活性，繼而通過

4、突變實驗對NisP蛋白C末端自剪切位點進(jìn)行了確定。
　　在NisP蛋白的C末端區(qū)域存在LPXTGX序列，在許多革蘭氏陽性細(xì)菌中，該序列與蛋白的細(xì)胞表面定位相關(guān)，NisP蛋白中C末端自剪切位點位于該序列之前，因而該C末端自剪切行為可能與NisP從細(xì)胞表面的釋放有關(guān)。為探索NisP中這種C末端自剪切行為的確切生物學(xué)意義，進(jìn)一步設(shè)計了C末端不能剪切的NisP突變體R647P/S648P。利用酶活實驗和抑菌實驗分析了NisP蛋白C末端不能

5、剪切對NisP活性的影響。
　　已知在許多枯草桿菌酶家族成員的結(jié)構(gòu)中，結(jié)合有不同數(shù)目的鈣離子，但在解析的NisP結(jié)構(gòu)中并沒有觀察到鈣離子的存在。根據(jù)之前文獻(xiàn)預(yù)測的NisP蛋白中可能的鈣離子結(jié)合位點，進(jìn)行結(jié)構(gòu)上分析，顯示該位點處氨基酸殘基主要呈線狀分布，沒有形成很好的金屬離子配位體系，因而該位點處未能結(jié)合鈣離子。同時測定了不同鈣離子濃度下NisP蛋白對合成底物的切割活性，結(jié)果顯示鈣離子對NisP蛋白活性沒有明顯影響，表明NisP蛋白