章魚胺的發(fā)酵制備及生物活性研究.pdf

1、章魚胺(Octopamine)作為重要的生物胺,在生物體內(nèi)起了神經(jīng)介質(zhì)的作用,近年的研究發(fā)現(xiàn)它是一種天然的β3-腎上腺素能受體激動(dòng)劑,有調(diào)節(jié)代謝與能量平衡的功效,在肥胖癥的治療和II型糖尿病的防治上有潛在的價(jià)值。章魚胺可以單獨(dú)或與其它原料聯(lián)合用于減肥與糖尿病的治療,可以作為食品、健康食品原料乃至臨床藥物的輔助制劑。枳實(shí)和魚露是天然章魚胺的主要來(lái)源,但枳實(shí)中章魚胺的含量?jī)H為0.01~0.03％,而魚露中相對(duì)豐富的章魚胺含量(0.01~0.

2、1%),使從魚露中提取章魚胺開(kāi)發(fā)健康產(chǎn)品成為可能。本課題旨在利用水產(chǎn)品加工的廢棄物制備速釀魚露,從中提取章魚胺,并研究章魚胺的生物活性。本論文利用智利外海莖柔魚(Dosidicus gigass)的內(nèi)臟為原料,采用保溫、加曲保溫、加酶保溫等不同速釀方法制備魚露,測(cè)定了魚露釀造過(guò)程中章魚胺含量的變化;并參照魚露中章魚胺的生成路徑,嘗試以酪胺為底物生物轉(zhuǎn)化生成章魚胺。本論文研究從魚露中提取章魚胺的有效方法,以探討從魚露中提取章魚胺開(kāi)發(fā)健康產(chǎn)

3、品的可能性。在章魚胺的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中,研究了章魚胺對(duì)營(yíng)養(yǎng)肥胖小鼠的減肥作用。最后以章魚胺為原料合成了十種章魚胺衍生物,測(cè)定了它們的抗氧化活性,并與章魚胺的前體化合物酪胺對(duì)比,以期對(duì)章魚胺的生物活性做進(jìn)一步研究。
　　1.魚露釀制過(guò)程中章魚胺的產(chǎn)生
　　以智利外海莖柔魚內(nèi)臟為原料,采用保溫、加曲保溫、加酶保溫等不同速釀方法制備魚露,測(cè)定魚露在不同釀制階段的pH值、氨基酸態(tài)氮和章魚胺含量,并對(duì)最終樣品作感官評(píng)價(jià)。結(jié)果表明:釀制20d

4、內(nèi),pH值變化顯著,上升速度較快,從弱酸性升至中性或弱堿性;在此期間,氨基酸態(tài)氮的變化也較為顯著,其濃度增加了15mg·mL-1以上,20d后趨于穩(wěn)定;魚露釀制前期,章魚胺含量逐漸增加,15-20d時(shí),達(dá)到最大值,高于5mg·mL-1,加酶保溫速釀的樣品中章魚胺含量甚至超過(guò)7mg·mL-1。20d后,魚露中章魚胺的含量呈下降趨勢(shì)。為與速釀魚露作對(duì)比,本研究測(cè)定了常溫自然釀制魚露在釀制過(guò)程中pH值、氨基酸態(tài)氮和章魚胺含量的變化。結(jié)果顯示,

5、在常溫自然釀制魚露中的各種變化速度較速釀魚露緩慢得多。30d后,pH值仍保持在酸性范圍內(nèi),氨基酸態(tài)氮的濃度僅增加了5mg·mL-1左右,章魚胺含量為3.5mg·mL-1,僅為加酶保溫速釀樣品中章魚胺含量峰值的一半。
　　本研究利用莖柔魚的不可食部分釀制魚露,可以發(fā)現(xiàn)在釀制過(guò)程中章魚胺含量明顯提高,表明釀造過(guò)程可有效提高章魚胺含量,這可為水產(chǎn)品加工的下腳料和廢棄物的綜合利用提供一條途徑。本研究對(duì)于釀制半年以上的保溫速釀魚露樣品中的章

6、魚胺含量也進(jìn)行了測(cè)定,發(fā)現(xiàn)仍然高達(dá)4.5mg·mL-1以上。說(shuō)明魚露可長(zhǎng)期保持較高的章魚胺水平。若將速釀魚露做為提取章魚胺的原料,可任選保溫、加曲保溫、加酶保溫三種速釀方法之一,20d的釀制時(shí)間即可。
　　感官評(píng)定的結(jié)果表明保溫和加曲保溫速釀的樣品在氣味上有較濃的魚香氣,而加酶保溫速釀的樣品腥氣較重,氣味不佳。對(duì)保溫速釀魚露中組胺和重金屬含量測(cè)定的結(jié)果表明其中組胺及砷、鎘的含量均已超標(biāo),因此,從安全性考慮,用智利外海莖柔魚內(nèi)臟釀制

7、的魚露不適于直接作為調(diào)味品食用。
　　2.酪胺發(fā)酵生物合成章魚胺
　　魚露在漫長(zhǎng)的發(fā)酵過(guò)程中,細(xì)胞色素P450酶系(cytochrome P450s,CYP450)對(duì)章魚胺的生物合成起了關(guān)鍵的作用。文獻(xiàn)資料顯示在研究細(xì)胞色素P450酶的活性時(shí)往往要使用價(jià)格昂貴的超速冷凍離心機(jī)提取動(dòng)物肝臟中的微粒體。本文參照魚露中章魚胺的生成路徑,用高速冷凍離心機(jī)提取了含有細(xì)胞色素P450酶的草魚肝臟S-9部位,并以之為酶源,以維生素C為氫載

8、體,異煙肼為單胺氧化酶抑制劑,以酪胺為原料生物轉(zhuǎn)化生成章魚胺。提取得到的S-9部位冷藏在4℃條件下,其中的細(xì)胞色素P450酶活性只能保持4小時(shí)左右,而-25℃冷藏條件下其活性可保持8-10天。生物合成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示氫載體對(duì)生物合成章魚胺是必需的,反應(yīng)1h產(chǎn)生的章魚胺為879.66μg/4.5mL反應(yīng)液,章魚胺的生物合成率為21.4%,酪胺代謝率為90.0%。這表明以草魚肝臟S-9部位為酶源生物轉(zhuǎn)化生成章魚胺是可行的,但由于P450酶系的

9、非專一性,章魚胺的生物合成率較低,有待進(jìn)一步改進(jìn)。
　　3.魚露中章魚胺的分離和提取
　　魚露中章魚胺的含量較為豐富,高于其他許多水產(chǎn)品。從魚露中有效提取章魚胺并進(jìn)行精制,可以為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用天然章魚胺打下基礎(chǔ)。從智利外海莖柔魚內(nèi)臟速釀魚露中提取章魚胺,可使廢棄物得以綜合利用,減少資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。本文中采用靜態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)吸附相結(jié)合的方法,綜合考慮吸附量、解吸率等因素,研究硅膠分離提取魚露中章魚胺的吸附性能和洗脫參數(shù)。結(jié)果

10、表明:60~100目硅膠對(duì)魚露中章魚胺有較好的吸附分離效果,靜態(tài)飽和吸附量達(dá)3.837mg·g-1(干硅膠),30%的乙醇水溶液為最佳洗脫劑,洗脫率達(dá)90.48%;60~100目硅膠對(duì)魚露中章魚胺動(dòng)態(tài)吸附的最佳上樣量為4BV,用1.1BV洗脫液可基本洗脫完全。得到的洗出液采用HPLC分離系統(tǒng),在流動(dòng)相0.02mol·L-1檸檬酸-0.02mol·L-1磷酸二氫鈉(7∶3),PH=3、流速10mL·min-1、檢測(cè)波長(zhǎng)274 nm的條件下

11、被色譜柱SepaxHP-C18柱(21.2mm×250mm,10μm)精制,真空冷凍干燥后得到白色粉末狀固體。將此白色固體與標(biāo)準(zhǔn)品章魚胺在同樣的條件下進(jìn)行質(zhì)譜分析,可證明得到的白色粉末狀固體為純度較高的天然章魚胺。
　　4.章魚胺和市售減肥藥對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖小鼠減肥作用的比較
　　在章魚胺的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中,本實(shí)驗(yàn)比較了章魚胺和市售減肥藥對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖小鼠的減肥作用。采用高脂飼料喂養(yǎng)4周構(gòu)建營(yíng)養(yǎng)性肥胖小鼠模型。再將小鼠分組喂養(yǎng)4周后發(fā)現(xiàn)

12、,飼料中加入一定劑量章魚胺和減肥藥的小組中小鼠體重、Lee’s指數(shù)、脂肪濕重、脂肪系數(shù)、血清總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)與模型組存在顯著性差異(P<0.05)。以上結(jié)果表明章魚胺對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖小鼠有一定的減肥降脂作用。
　　5.章魚胺衍生物的合成及抗氧化活性研究
　　關(guān)于章魚胺的生物活性,文獻(xiàn)報(bào)道大多為肥胖癥的治療和II型糖尿病防治方面的研究。既往研究指出,章魚胺的前體化合物酪胺具有較高的抗氧化活性,且與其濃度呈正相關(guān)。

13、本文以章魚胺為原料合成十種衍生物,并對(duì)它們進(jìn)行核磁共振氫譜和質(zhì)譜定性分析,確證其結(jié)構(gòu)。為比較章魚胺、酪胺及章魚胺衍生物的抗氧化活性,本文測(cè)定了這些物質(zhì)對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基的清除率。研究結(jié)果表明,章魚胺及其兩種衍生物OA07和OA08,即N-正十一烷基甲?；?2-羥基-2-(4-羥基苯基)-乙胺和 N-(2-硝基-3-甲基苯甲?；?-2-羥基-2-(4-羥基苯基)-乙胺,清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基

14、自由基的能力均高于酪胺;另一章魚胺衍生物OA05,即N-(4-硝基苯甲?；?-2-羥基-2-(4-羥基苯基)-乙胺具有較高的超氧陰離子自由基清除能力,值得進(jìn)一步關(guān)注和研究。
　　由于國(guó)內(nèi)目前有關(guān)章魚胺的研究報(bào)告或產(chǎn)品較少,本課題的研究有可能進(jìn)一步推動(dòng)對(duì)章魚胺的研究,為更好地生產(chǎn)和應(yīng)用章魚胺提供一定的理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)鳀魚(Engraulis)和七星魚(Channa asiatica)魚露原液中章魚胺含量較高