甘油糖脂的分離制備及生物活性研究.pdf

1、甘油糖脂具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗動脈粥樣硬化等多種生物活性，存在于動物的神經(jīng)組織、植物和微生物中。本論文采用高速逆流色譜分離技術(shù)和制備型高效液相相結(jié)合的方法，以南瓜和生姜為原料，探索出一套完整的活性成分甘油糖脂的提取、分離、純化的工藝。同時，對分離純化的甘油糖脂單體進一步研究其生物活性，包括降血糖、抗炎、抗腫瘤及抗氧化活性，并闡明其結(jié)構(gòu)與功效之間的關(guān)系，以期為進一步開發(fā)利用南瓜和生姜資源提供實驗依據(jù)。
　　 研

2、究結(jié)果如下：
　　 1、南瓜正丁醇提取物采用D4020型大孔吸附樹脂，利用水和20％、40％、60％、80％和95％的乙醇溶液洗脫提純得到不同極性的組分。60％的洗脫部分以二氯甲烷-石油醚-乙醇-水(6：2：4：4，v/v/v/v)為溶劑系統(tǒng)，采用雙向洗脫方式，經(jīng)高速逆流色譜HSCCC-D1200分離得到3種組分GCL1、GCL2和CCL3。
　　 進一步利用制備型反相高效制備液相色譜對3種組分進行分離純化，以乙腈-水(

3、55:45，v/v)為流動相，ODS-BP-A(250 mm×30 mm，15μm)為色譜柱，201 nm為檢測波長，流動相流速為10 mL/min，制備分離得到4個甘油糖脂單體，分別為：1-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-3-O-[β-D-galactOpyranOsyl-(1→6)-0—β-D-galactOpyranOsyl-(1→6)—β-D-galaCtOpyranOsyl]glycerol,1

4、-O-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol,1-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-

5、D-galacto-pyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol和1-O-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol。它們的結(jié)構(gòu)經(jīng)EMS-M

6、S,1HNMR,13CNMR,2D-NMR(TOCSY,HMQC,HMBC,和NOESY)鑒定為新化合物。
　　 2、生姜正丁醇提取物采用反相分離填料MCI GEL CHP20P，利用水和30％、60％和90％的甲醇溶液洗脫提純得到不同極性的組分。90％甲醇洗脫部分以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1：1：1：1，v/v/v/v)為溶劑系統(tǒng)，采用高速逆流色譜分離得到鞘糖脂大豆腦苷I(Soya-cerebroside I)和富含甘油糖

7、脂的另一組分A。FrA進一步利用制備型反相高效液相色譜法，在0DS-BP-A色譜柱(250mmX30mm,15μm)上，以乙腈-水(55:45, v/v)作為流動相，流速10 mL/min,檢測波長201nm，采用等度洗脫方式，得到2個甘油糖脂單體，分別為1-O-(9Z,12Z,15Z-octadecatrienoyl)-3-O-[α-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]gly

8、cerol和1-O-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-3-O-[α-D-galactopy-ranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol.60％甲醇洗脫部分以TBME-甲醇-水(2:1:1, v/v/v)為溶劑系統(tǒng)，采用高速逆流色譜分離得到4種化合物，分別為5-hydroxybomyl-2-O-β-D-glucopyranoside,(R)-3,7-Dimethyloct-2

9、E-en-1,6,7-triol,p-epi-menthane-1,2,8-triol2-O-β-D-glucopyranoside和p-menthane-1,2,8-triol2-O-β-D-glucopyranoside。30％甲醇洗脫部分以氯仿-甲醇-水(5:4:3, v/v/v)為溶劑系統(tǒng)，采用高速逆流色譜分離得到2種化合物，分別為1-(4-O-β-D-Glucopyranosyl-3-methoxyphenyl)-3,5-di

10、hydroxydecane和apigenin-7-O-rutinoside。它們的結(jié)構(gòu)經(jīng)EMS-MS,1HNMR,13CNMR,2D-NMR(TOCSY，HMQC，HMBC，和NOESY)進行了鑒定，其中兩種單萜苷為新化合物。
　　 3、采用長期高脂高糖飲食-鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)II型糖尿病小鼠模型研究了6種甘油糖脂降血糖活性，結(jié)果表明，甘油糖脂(50mg/(kg bw?d))有很好的降血糖效果

11、。特別是四半乳糖亞麻酸單酰甘油(QGMG，18:3)，其降血糖效果與模型對照組比較在第1周后即達顯著水平，第2周后達極顯著水平，且效果優(yōu)于糖尿病藥二甲雙胍(P<0.05)。
　　 結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，降血糖活性與甘油糖脂分子中的糖基數(shù)目和脂?；娘柡投扔嘘P(guān)。糖基數(shù)目越多，降血糖作用越強；脂?；伙柡碗p鍵越多，活性越強?？梢酝茢?，糖基結(jié)構(gòu)是甘油糖脂降血糖活性的必須結(jié)構(gòu)，而不飽和脂酰基的存在對活性的提高具有協(xié)同效應(yīng)。
　

12、　 4、采用巴豆油所致炎癥模型研究了6種甘油糖脂的抗炎作用，結(jié)果表明，甘油糖脂(20 mg/mL)具有顯著的抗炎能力。構(gòu)效關(guān)系研究表明，分子中半乳糖基數(shù)目一定，抗炎能力隨著脂?；伙柡统潭鹊脑黾佣岣?；脂酰基組成相同，抗炎能力隨著半乳糖基數(shù)目的增加而降低。
　　 5、采用MTT試驗評價了6種甘油糖脂對COL0205、B16-F1O、A5493種腫瘤細胞株的體外細胞毒性。實驗結(jié)果顯示甘油糖脂對3種腫瘤細胞COL0205、BI6-

13、F10、A549的增殖具有一定的抑制作用，且呈一定的劑量關(guān)系，其中甘油糖脂對COL0205、B16-F1腫瘤細胞抑制效果比對A549腫瘤細胞更明顯，提示其對不同腫瘤的抑制活性可能存在選擇性差異。
　　 初步的構(gòu)效關(guān)系表明，隨著半乳糖基數(shù)目的增多，甘油糖脂抗腫瘤活性減弱，雙糖或三糖活性較強，四糖活性較弱。糖苷鍵的類型(α、β)對活性也有一定的影響。如果半乳糖基存在α及β構(gòu)型，糖基數(shù)目一定，脂?；鶠閬営退岷椭；鶠閬喡樗岬母视吞侵?/p>

14、抗腫瘤活性差異較大，如DGMG(18:3)、DGMG(18:2)對人肺腺癌A549細胞的抑制作用相當，對人結(jié)腸癌COL0205細胞的抑制作用，DGMG(18:3)強于DGMG(18:2)，而對小鼠黑色素瘤B16-F10細胞的抑制作用，DGMG(18:2)卻強于DGMG(18:3)。如果分子中半乳糖僅存在β構(gòu)型，糖基數(shù)一定，脂?；鶠閬営退岬母视吞侵钚源笥谥；鶠閬喡樗岬幕钚?。
　　 6、采用DPPH?法評價了6種甘油糖脂單體的抗

15、氧化活性，實驗結(jié)果表明，在濃度范圍50-500μg/mL內(nèi)，各甘油糖脂單體對DPPH自由基具有一定的清除作用。構(gòu)效關(guān)系表明，隨著半乳糖基數(shù)目的增多，活性增強，雙糖或三糖活性較弱，四糖活性較強。糖基構(gòu)型不同，脂?；柡投鹊牟煌瑢钚杂绊懸膊煌?。如果分子中半乳糖基存在α及β構(gòu)型，糖基數(shù)目一定時，脂酰基為亞麻酸的甘油糖脂抗氧化活性強于脂?；鶠閬営退岬母视吞侵?；如果分子中半乳糖基僅存在β構(gòu)型，糖基數(shù)目一定時，脂?；鶠閬営退岬母视吞侵寡趸钚源?/p>