甘油激酶與核受體Nur77相互作用及其對(duì)肝臟脂代謝調(diào)控研究.pdf

1、本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，GK與核孤兒受體Nur77存在蛋白質(zhì)相互作用。近年研究表明，Nur77和GK與肝臟脂代謝過程存在密切聯(lián)系，提示GK與Nur77可能通過蛋白質(zhì)相互作用對(duì)肝臟脂代謝進(jìn)行調(diào)控。本文對(duì)GK和Nur77相互作用進(jìn)行深入研究，揭示其對(duì)肝臟脂代謝調(diào)控功能的影響，為脂代謝調(diào)控和代謝類疾病的發(fā)病機(jī)制和治療提供線索；同時(shí)為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立基礎(chǔ)，構(gòu)建了GK-pCDH過表達(dá)慢病毒和GK-pSicoR干涉慢病毒載體，獲得穩(wěn)定過表達(dá)/干涉GK的

2、慢病毒。
　　本文首先利用免疫共沉淀技術(shù)，對(duì)GK與Nur77相互作用及作用域進(jìn)行確認(rèn)。進(jìn)而利用Nur77對(duì)熒光素酶報(bào)告基因ApoA5promoter的轉(zhuǎn)錄激活作用，檢測(cè)GK對(duì)Nur77的轉(zhuǎn)錄激活活性的影響。同時(shí)，選取幾個(gè)受Nur77調(diào)控的脂代謝相關(guān)基因，在人肝細(xì)胞系L02及小鼠體內(nèi)同時(shí)轉(zhuǎn)染GK和Nur77的表達(dá)載體，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)各基因在肝中mRNA水平表達(dá)狀況。此外，將GK的CDS序列構(gòu)建到pCDH慢病毒質(zhì)粒中，并

3、將有效干涉GK的siRNA序列構(gòu)建到pSicoR慢病毒質(zhì)粒中，293T細(xì)胞包裝獲得慢病毒，檢測(cè)慢病毒滴度，并對(duì)GK慢病毒過表達(dá)/干涉效果進(jìn)行檢測(cè)。
　　由免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)GK與Nur77存在相互作用，GK的N端和C端是相互作用的結(jié)構(gòu)域。GK使Nur77報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性降低，激活倍數(shù)可3倍降低至0.5倍，抑制效果明顯，且不依賴于GK的激酶活性。Real-timePCR結(jié)果顯示Nur77對(duì)Srebp-1c、Fas、Gpam和Acac