運(yùn)用基因工程技術(shù)構(gòu)建乳糖發(fā)酵短桿菌L-蘇氨酸生產(chǎn)菌.pdf

1、L-蘇氨酸在食品、飼料、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,其市場(chǎng)需求量呈長(zhǎng)期穩(wěn)定增長(zhǎng)趨勢(shì)。微生物發(fā)酵法是目前生產(chǎn)L-蘇氨酸的主要方式。經(jīng)多輪反復(fù)誘變得到的生產(chǎn)菌株,遺傳背景不明,生長(zhǎng)緩慢,進(jìn)一步誘變以提高產(chǎn)量將十分困難且提高空間很小。運(yùn)用基因工程手段進(jìn)行菌種改造,將為在現(xiàn)有高產(chǎn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高L-蘇氨酸產(chǎn)量帶來新的突破。
　　 本論文研究從一株通過傳統(tǒng)誘變方法選育得到的Brevibacterium lactofermentum

2、L-異亮氨酸高產(chǎn)菌JHI3-156(L-蘇氨酸是L-異亮氨酸生物合成的前體)中克隆出天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶和高絲氨酸激酶的編碼基因lysCM、homM和thrB,通過測(cè)序及序列比對(duì)分析,確定了lysCM和homM上具有有利于L-蘇氨酸積累的突變位點(diǎn)。然后將這些突變基因在野生型B.lactofermenlum ATCC13869中表達(dá),研究其對(duì)L-蘇氨酸積累的影響,構(gòu)建得到一株L-賴氨酸生產(chǎn)菌和一株L-蘇氨酸和L-賴氨酸生產(chǎn)菌。主要

3、研究結(jié)果如下:
　　 1、確定了lysCM上的突變位點(diǎn):與野生型相比,lysCM1186G、1187C缺失,導(dǎo)致其后6個(gè)氨基酸殘基發(fā)生突變,同時(shí)導(dǎo)致402位密碼子為終止密碼子TGA,翻譯提前終止;此外還有2個(gè)有義突變位點(diǎn):Ala279 Thr,Ser317 Ala。經(jīng)過對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)這些突變與天冬氨酸激酶受L-蘇氨酸和L-賴氨酸的協(xié)同反饋抑制調(diào)節(jié)密切相關(guān)。Ala279 Thr突變?cè)贚-蘇氨酸結(jié)合域內(nèi),會(huì)導(dǎo)致天冬氨酸激酶

4、β亞基與α亞基的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域不能形成穩(wěn)定的二聚體;Ser317 Ala突變的意義尚不清楚,但該位點(diǎn)靠近L-賴氨酸結(jié)合域;147～152位氨基酸突變及153～172位氨基酸缺失,破壞了調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域上ACT2結(jié)構(gòu)域的特征結(jié)構(gòu)ββαββα;153～172位氨基酸缺失還造成在L-賴氨酸的反饋調(diào)節(jié)過程中起重要作用的β9(β)股結(jié)構(gòu)缺失。
　　 2、確定了homM上的突變位點(diǎn):與野生型相比,共有5個(gè)堿基不同,導(dǎo)致2個(gè)有義突變:Gly148 Al

5、a、Gly378 Ser。Gly148 Ala突變位于高絲氨酸脫氫酶的N-端輔酶NAD結(jié)合域內(nèi),意義尚不清楚;Gly378 Ser突變位于C-端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域內(nèi),對(duì)解除高絲氨酸脫氫酶受L-蘇氨酸的反饋抑制具有重要作用。
　　 3、在B.lactofermentum ATCC13869中,利用表達(dá)載體pDXW-8將其自身的野生型lysC、hom和thrB進(jìn)行共表達(dá),研究了其對(duì)L-蘇氨酸積累的影響。96h搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明:L-蘇氨酸產(chǎn)量

6、幾乎不變,僅由0.045g/L提高至0.050g/L。
　　 4、在B.lactofermentum ATCC13869中,利用表達(dá)載體pDXW-8表達(dá)lysCM。96h搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明:lysCM的表達(dá)對(duì)提高L-蘇氨酸產(chǎn)量作用較小,僅由0.0415g/L提高至0.064g/L;但使L-賴氨酸產(chǎn)量提高了34倍,由0.209g/L升至7.4g/L。該重組菌株在3L罐上發(fā)酵72h,L-賴氨酸產(chǎn)量可達(dá)40g/L。
　　 5、在

7、B.lactofermentum ATCC13869中,利用表達(dá)載體pDXW-8表達(dá)homM-thrB操縱子。96h搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明:L-蘇氨酸產(chǎn)量提高了3.5倍,由0.045g/L升至0.202g/L。
　　 6、在B.lactofermentum ATCC13869中,利用表達(dá)載體pDXW-8共表達(dá)lysCM和homM-thrB。96h搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明:L-蘇氨酸產(chǎn)量提高了17.2倍,由0.045g/L升至0.820g/L;

8、而L-賴氨酸積累更多,達(dá)3.789g/L。
　　 7、對(duì)共表達(dá)lysCM和homM-thrB的重組菌株13869-3進(jìn)行初步發(fā)酵優(yōu)化。(1)提高溶氧水平。通過在3L罐上控制溶氧水平:延遲期30％,對(duì)數(shù)期50％和平穩(wěn)期30％,13869-3發(fā)酵70h后產(chǎn)4.1g/L L-蘇氨酸和23g/L L-賴氨酸。(2)降低初始糖濃度。通過控制較低的糖濃度:初始糖濃度4.5％和發(fā)酵過程2％,13869-3在96h搖瓶發(fā)酵中產(chǎn)3.185g/LL