基于代謝工程選育谷氨酸棒桿菌L-蛋氨酸高產(chǎn)菌.pdf

1、國內(nèi)圖書分類號：Q939.97 學(xué)校代碼：10213 國際圖書分類號：579.25 密級：公開 工學(xué)博士學(xué)位論文 學(xué)博士學(xué)位論文 基于代謝工程選育谷氨酸棒桿菌 L-蛋氨酸高產(chǎn)菌 博 士 研 究 生 ： 李 瑩 導(dǎo) 師 ： 楊 謙教授 申 請 學(xué) 位 ： 工學(xué)博士 學(xué) 科 ： 生物

2、醫(yī)學(xué)工程 所 在 單 位 ： 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 答 辯 日 期 ： 2016 年 10 月 授予學(xué)位單位 ： 哈爾濱工業(yè)大學(xué) 摘 要 摘 要 L-蛋氨酸是唯一一種含硫必需氨基酸，在生命體各種重要的代謝活動中起著不可替代的作用，被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域。作為一種飼料添加劑，其需求量巨大且附加值高，工業(yè)上蛋氨酸的生產(chǎn)方法仍是化學(xué)合成法或水解蛋白法。鑒于 L-蛋氨酸至今未實現(xiàn)微生物發(fā)酵法工業(yè)生產(chǎn)，且其代謝工程理論研究

3、匱乏，本研究以谷氨酸棒桿菌 ATCC13032 為出發(fā)菌株， 基于代謝工程原理， 構(gòu)建了一株高產(chǎn) L-蛋氨酸的工程菌株，并分析不同遺傳操作對 L-蛋氨酸產(chǎn)量的影響，進而尋找出 L-蛋氨酸生物合成途徑中的關(guān)鍵靶點。其主要研究結(jié)果如下： 為了獲得一株過產(chǎn) L-蛋氨酸的平臺菌株， 本研究首先分析了不同 L-蛋氨酸吸收系統(tǒng)缺失對 L-蛋氨酸重吸收作用的影響。結(jié)果表明，MetD 蛋白復(fù)合體是L-蛋氨酸的主要吸收系統(tǒng)，并且谷氨酸棒桿菌△metD 的

4、 L-蛋氨酸產(chǎn)量最高。在谷氨酸棒桿菌△metD 的基礎(chǔ)上，通過誘變解除了來自末端代謝產(chǎn)物對 L-蛋氨酸合成途徑的反饋抑制作用。獲得了一株具有 L-蛋氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性的突變株谷氨酸棒桿菌 5-16，其 L-蛋氨酸產(chǎn)量為 2.54 g/L，提升了約 9 倍，對底物得率為 0.028 mol/mol。 該菌株中 L-蛋氨酸分支合成途徑的 7 個酶的轉(zhuǎn)錄水平均有顯著提高，且遺傳性能穩(wěn)定，是一株優(yōu)良的 L-蛋氨酸生產(chǎn)平臺菌株。 為了強化 L-蛋

5、氨酸合成途徑，本研究采用基因敲除和基因定點突變技術(shù)，阻斷或弱化了 L-蛋氨酸的競爭代謝徑，并解除了來自中間代謝產(chǎn)物的反饋抑制作用。敲除 thrB 基因阻斷了 L-蘇氨酸合成，替換 dapA 基因的強起始密碼子為弱起始密碼子削弱了 L-賴氨酸分支途徑， 定點突變 lysC 基因和 pyc 基因解除天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶的反饋抑制作用，最終獲得谷氨酸棒桿菌 LY-4。結(jié)果表明，天冬氨酸激酶節(jié)點對 L-蛋氨酸的生物合成有極顯著影響，L-蛋

6、氨酸產(chǎn)量最終上升至 5.89 g/L，對底物得率為 0.072 mol/mol。在谷氨酸棒桿菌 LY-4 遺傳背景下，敲除 mcbR 基因不利于 L-蛋氨酸生產(chǎn)。 構(gòu)建了一個新型大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭組成型表達載體 pLY-4。其具有一個含 11 個酶切位點的多克隆位點 MCS； 具有氯霉素抗性和基于 alr 基因的無選擇標(biāo)記兩套篩選系統(tǒng)，氯霉素抗性標(biāo)記適用于實驗室規(guī)模操作，alr 基因作為篩選標(biāo)記可滿足無抗生素條件下的發(fā)酵生產(chǎn)；