l-蘇氨酸生產(chǎn)菌的構(gòu)建及發(fā)酵優(yōu)化.pdf

1、L-蘇氨酸是人體必需氨基酸之一，在食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。在大腸桿菌發(fā)酵過程中，草酰乙酸作為前體物參與L-蘇氨酸的合成，增加前體物草酰乙酸的合成量，對于提高L-蘇氨酸產(chǎn)量有一定的幫助。此外，增加細(xì)胞內(nèi)NADPH的合成量，為L-蘇氨酸合成提供足夠的還原力，也是提高L-蘇氨酸產(chǎn)量的重要策略。優(yōu)化培養(yǎng)條件，在培養(yǎng)基中添加甜菜堿，對提高L-蘇氨酸的轉(zhuǎn)化率有積極作用。
　　在L-蘇氨酸發(fā)酵生產(chǎn)過程中，乙醛酸循環(huán)起到部分回補途徑的功

2、能。本實驗利用Red重組技術(shù)，以L-蘇氨酸生產(chǎn)菌Escherichia coli THRD為出發(fā)菌株，構(gòu)建了iclR基因缺失菌株THRD△iclR以及不同強度啟動子替換aceBAK啟動子的菌株THRD P1和THRD P2。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，THRD△iclR的L-蘇氨酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率分別為42.60±1.23 g/L和32.77％，較原菌THRD(35.32±1.07 g/L和27.17％)分別提高20.61％和20.70％。THR

3、D P1 L-蘇氨酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率分別為36.50±1.42 g/L和28.08％，較原菌THRD（35.32±1.07 g/L和27.17％）分別提高3.34％和3.39％。而THRD P2發(fā)酵8h后菌體生長停滯，最終L-蘇氨酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率分別為8.31±1.31 g/L和20.78％，較原菌THRD（35.32±1.07 g/L和27.17％）分別降低了76.47％和23.52％。綜上所述，適當(dāng)增強乙醛酸循環(huán)有利于L-蘇氨酸的

4、積累，而過強的乙醛酸循環(huán)會影響菌體的正常代謝。
　　丙酮酸羧化酶是供給草酰乙酸的主要補充反應(yīng)，但大腸桿菌中不含此酶。以L-蘇氨酸生產(chǎn)菌E.coli THRD為出發(fā)菌株，在大腸桿菌中異源表達(dá)來自枯草芽孢桿菌中的丙酮酸羧化酶基因pycA，搖瓶結(jié)果顯示，E.coli THRD+pWSK29-pycA的L-蘇氨酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率分別為46.09±1.58 g/L和30.72％，較E.coli THRD+pWSK29(41.05±2.51

5、g/L和27.37％)分別提高12.28％和12.24％;E.coli THRD+pTrc99a-pycA與E.coli THRD+pTrc99a相比，生物量提高了31.69％，而L-蘇氨酸的產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率分別為35.91±1.15 g/L和23.94％，較E.coli THRD+pTrc99a(40.06±1.25 g/L和26.71％)分別降低了10.36％和10.37％，表明適當(dāng)表達(dá)丙酮酸羧化酶有利于L-蘇氨酸的合成。隨后構(gòu)建了

6、基因整合菌E.coli THRD pykF∷pycA，發(fā)酵結(jié)束后，THRDpykF∷pycA的L-蘇氨酸產(chǎn)量與E.coli THRD△pykF相比變化并不明顯，表明在敲除丙酮酸激酶基因(pykF)的基礎(chǔ)上再異源表達(dá)pycA基因，對于L-蘇氨酸的積累影響不大。
　　NADPH是細(xì)胞內(nèi)重要的還原力，通過提高NADPH的供應(yīng)，增強L-蘇氨酸的代謝支路，能促進(jìn)蘇氨酸的合成，提高產(chǎn)率。本實驗以L-蘇氨酸生產(chǎn)菌E.coli THRD為出發(fā)菌株

7、，用來自丙酮丁醇梭桿菌中的NADP+依賴性3-磷酸甘油醛脫氫酶基因gapC替換在糖酵解途徑中起重要作用的NAD+依賴性3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因gapA，實驗證明，gapA替換成功后，胞內(nèi)NADPH的合成量得到提高，搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示，THRD gapA∷gapC L-蘇氨酸產(chǎn)量較原菌THRD略有提高;利用5L發(fā)酵罐進(jìn)行分批補料發(fā)酵實驗，結(jié)果表明，改造菌THRD gapA∷gapC L-蘇氨酸產(chǎn)量119.53 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率49.5

8、1％，較原菌(109.98 g/L，45.56％)分別提高了8.68％和8.67％。綜上所述，替換糖酵解途徑關(guān)鍵酶基因gapA，胞內(nèi)NADPH量增加，有利于大腸桿菌THRD高產(chǎn)L-蘇氨酸。
　　甜菜堿作為一種生物堿，可以調(diào)節(jié)胞內(nèi)滲透壓，提供甲基。本實驗以L-蘇氨酸生產(chǎn)菌Escherichia coli THRD為出發(fā)菌株，在培養(yǎng)基中分別添加甜菜堿鹽酸鹽與磷酸鹽，發(fā)酵結(jié)果表明，底料中先添加0.5 gL甜菜堿鹽酸鹽，再按1g/L隨糖流