嗜鐵鉤端螺旋菌在砷脅迫條件下的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、生物冶金工藝與其他物理化學(xué)冶金方法相比,具有成本低廉、環(huán)境友好、適于開采貧礦、難冶礦的特點(diǎn)。提高浸礦微生物的生物活性和適應(yīng)性,將有效提高生物冶金過程的生產(chǎn)效率。
　　 在目前已探明的金礦資源中,含砷金礦占有很大的比例,其中砷金比達(dá)到2000:1的金礦資源占總探明儲量的5％(劉四清宋煥斌,1998)。砷是一種具有毒性和致癌能力的半金屬物質(zhì)。在生物浸礦過程中經(jīng)常要處理砷黃鐵礦等含砷礦石。砷黃鐵礦的生物氧化過程主要由硫氧化細(xì)菌喜溫硫桿

2、菌(Acidithiobacillus caldus)、鐵氧化細(xì)菌嗜鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillum ferriphilum)以及鐵硫氧化菌氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)混合進(jìn)行。嗜鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillum ferriphilum)是生物浸礦反應(yīng)中主要的鐵氧化微生物,特別是在生物氧化處理過程的中后期高氧化還原電位條件下,是處于主導(dǎo)優(yōu)勢地位的鐵氧化菌。該菌主要以氧

3、化Fe2+產(chǎn)生Fe3+獲得能量,而Fe3+則是生物浸礦過程中重要的氧化劑。嗜鐵鉤端螺旋菌的氧化活性和生命活力將直接影響含砷礦物的生物浸出效率。如果處理樣品中的砷毒離子濃度超過了嗜鐵鉤端螺旋菌的砷耐受水平,生物浸出也就難以進(jìn)行。因此,深入了解嗜鐵鉤端螺旋菌的砷耐受能力,砷抗性機(jī)制,將為進(jìn)一步的微生物育種提供理論指導(dǎo)。
　　 但是由于嗜鐵鉤端螺旋菌的遺傳背景,生理代謝等研究甚少,無法直接從該菌現(xiàn)有的生理調(diào)節(jié)機(jī)制及遺傳基礎(chǔ)入手獲得該菌

4、的砷抗性機(jī)制。所以,采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究策略,引入雙向電泳等蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù),全局性的研究該菌的砷耐受機(jī)制是一種可行的方法。
　　 雙向電泳技術(shù)(Two dimensional electrophoresis,2-DE)可以全局性、高通量研究微生物的蛋白質(zhì)表達(dá)差異,高分辨率,高靈敏度的展示和分離出現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白,是分析復(fù)雜混合物和蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的關(guān)鍵技術(shù)。微生物與外界環(huán)境的相互作用和生物學(xué)響應(yīng)往往是通過多個(gè)系統(tǒng)的綜合協(xié)

5、調(diào)來完成的,涉及多種酶系和調(diào)控系統(tǒng)的變化,這正是蛋白質(zhì)組學(xué)的著眼點(diǎn)。因此,構(gòu)建L.ferriphilum的2-DE分析技術(shù)平臺,并在此基礎(chǔ)上采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)來研究L.ferriphilum的抗砷、耐砷機(jī)制是科學(xué)合理的選擇。
　　 L.ferriphilum是極端嗜酸性專性化能自養(yǎng)革蘭氏陰性菌。其獲能途徑?jīng)Q定了該菌培養(yǎng)物中菌體密度小,各種可溶性離子雜質(zhì)濃度高。而2-DE技術(shù)則要求樣品中蛋白濃度較高,雜質(zhì)濃度,尤其是各種可溶性

6、離子雜質(zhì)濃度盡可能的低。因此,普通的2-DE方案無法獲得分離良好,點(diǎn)量豐富的L.ferriphilum2-DE圖譜,目前國內(nèi)外還沒有關(guān)于L.ferriphilum全局蛋白2-DE實(shí)驗(yàn)的報(bào)道。本研究通過對2-DE的樣品制備、雜質(zhì)去除、上樣方法、聚焦參數(shù)選擇、染色方法等關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn),制定了一套適用于L.ferriphilum的2-DE實(shí)驗(yàn)方案,首次獲得了點(diǎn)陣清晰,可穩(wěn)定重現(xiàn),膠體考馬斯染色法獲得獨(dú)立蛋白點(diǎn)達(dá)到600個(gè)以上的L.fer

7、riphilum2-DE圖譜。
　　 在此基礎(chǔ)上,為了開展L.f砷脅迫條件下的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究,本研究通過馴化培養(yǎng)獲得具有較高耐砷性能的L.f菌株,通過2D電泳技術(shù)把耐砷菌株和普通對照菌株的菌體蛋白進(jìn)行比較,確定差異蛋白,通過MALDI-TOF、MS/MS技術(shù)和相關(guān)生物信息學(xué)檢索比對工具對差異蛋白進(jìn)行分析。從而更全面地了解L.f的耐砷機(jī)制。目前已知的微生物耐砷抗砷系統(tǒng)主要是廣泛存在的Arsenic Resistance Sys

8、tem,即Ars系統(tǒng)。近期還有報(bào)道在砷脅迫條件下,某些熱激蛋白(HSP蛋白),產(chǎn)能代謝相關(guān)蛋白,質(zhì)膜陰離子通道蛋白的表達(dá)量也會提高。顯示在砷脅迫條件下,細(xì)胞試圖通過排出毒性離子、提高能源供給、提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等途徑維持正常的生理生化活動。通過對L.ferriphilum ML-04的耐砷菌株和普通出發(fā)菌株的蛋白質(zhì)2-DE圖譜進(jìn)行數(shù)字化比對和分析,發(fā)現(xiàn)65個(gè)蛋白點(diǎn)出現(xiàn)超過3倍的表達(dá)量變化(t-test,p<0.05)。有38種蛋白得到高

9、分匹配和識別,其中,有25種蛋白質(zhì)匹配確認(rèn)了具體的生物學(xué)功能。其中很多蛋白有助于提高細(xì)胞對砷的耐受能力,包括促進(jìn)三價(jià)砷離子的排出以保護(hù)一些重要蛋白的穩(wěn)定性；保護(hù)和促進(jìn)修復(fù)染色體,保障染色體的復(fù)制過程；避免重要的硫、磷元素的浪費(fèi)；保持一些重要的砷耐受蛋白的活性等。而且,為了更有效的保護(hù)細(xì)胞,提高砷耐受能力,L.ferriphilumML-04還通過改變代謝通路中一些關(guān)鍵酶的表達(dá)量調(diào)整了細(xì)胞內(nèi)一些代謝通路,例如碳水化合物的代謝、能量代謝、氨

10、基酸代謝等。
　　 此外,該蛋白質(zhì)組學(xué)研究還檢測到了2套Ars砷抗性系統(tǒng)。一套是arsRC-arsB型的LfML04Ars1基因簇,一套是arsRDABC型LfML04Ars2基因簇。與先前報(bào)道的arsRDABC基因簇相比,LfML04Ars2基因簇中還多了一個(gè)編碼框,編碼了Pst型磷酸特異性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的PstS蛋白。該P(yáng)stS蛋白所屬的Pst磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是細(xì)胞應(yīng)對磷酸饑餓及抗五價(jià)砷毒離子相關(guān)系統(tǒng)。該系統(tǒng)的組成蛋白出現(xiàn)在砷抗性系

11、統(tǒng)中,暗示在嗜鐵鉤端螺旋菌ML-04菌株中,砷抗性系統(tǒng)與某些磷酸饑餓響應(yīng)系統(tǒng)存在聯(lián)動關(guān)系。由于砷毒離子可以造成細(xì)胞磷酸饑餓,并可以干擾細(xì)胞內(nèi)的多種磷酸化反應(yīng)過程,這種砷抗性系統(tǒng)與磷酸饑餓響應(yīng)系統(tǒng)的聯(lián)動可以使ML-04獲得更強(qiáng)的砷耐受能力。
　　 本研究建立的嗜鐵鉤端螺旋菌2-DE技術(shù)平臺及相關(guān)研究策略,可應(yīng)用于嗜鐵鉤端螺旋菌對其他多種環(huán)境條件變化的細(xì)胞適應(yīng)性機(jī)制的研究,例如與生物浸礦密切相關(guān)的其他金屬毒性離子的抗性和耐受機(jī)制、能