嗜鐵鉤端螺旋菌Lepptospirillurm ferriphilumUBK03抗鎳操縱子表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室從嗜鐵鉤端螺旋菌UBK03中克隆到一個(gè)與鎳抗性相關(guān)的操縱子ncrABCY,該操縱子含4個(gè)結(jié)構(gòu)基因ncrA,ncrB,ncrC及ncrY。NcrA為該抗性系統(tǒng)的核心組件,與輔助蛋白NcrC組裝成跨膜通道,NcrY對(duì)抗鎳系統(tǒng)起負(fù)作用,NcrB作為阻遏蛋白能夠調(diào)節(jié)ncrA基因的表達(dá)。本論文研究是以此操縱子為對(duì)象,開展了其表達(dá)調(diào)控機(jī)理的研究。
　　 將ncrABCY轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109得到克隆子NR21。通過(guò)比較未經(jīng)Ni2+誘

2、導(dǎo)及經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的NR21菌株在含Ni2+LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況,發(fā)現(xiàn)未經(jīng)誘導(dǎo)的NR21菌株生長(zhǎng)比經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的NR21菌株要滯后2小時(shí),說(shuō)明ncrABCY受Ni2+誘導(dǎo)表達(dá)。RT-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄分析,發(fā)現(xiàn)Ni2+能夠增強(qiáng)ncrA,ncrB,ncrC的轉(zhuǎn)錄水平,熒光定量PCR結(jié)果顯示在含Ni2+LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的NR21菌株ncrA的轉(zhuǎn)錄量要比在普通LB培養(yǎng)基中高10倍。
　　 利用S1 mapping實(shí)驗(yàn)確定了ncrA基因的轉(zhuǎn)錄

3、起始位點(diǎn)。對(duì)ncrA啟動(dòng)子pncrA序列分析,在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)了一段富含GC的反向重復(fù)序列p1p17,并且通過(guò)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)和DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn),確定NcrB蛋白能夠與pncrA上的反向重復(fù)序列p1p17特異結(jié)合。
　　 細(xì)菌單雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在菌株體內(nèi)檢測(cè)了NcrB與pncrA的相互結(jié)合作用。并且還發(fā)現(xiàn),在細(xì)菌單雜交正篩選培養(yǎng)基中加入1mM Ni2+,NcrB與pncrB的結(jié)合作用能夠被解除。由此可知,NcrB是一個(gè)受鎳調(diào)控

4、的金屬調(diào)節(jié)蛋白。此外通過(guò)構(gòu)建一系列pncrA截短片段,發(fā)現(xiàn)只有完全包含p1p17的截短片段才能夠與NcrB結(jié)合。這也說(shuō)明NcrB能通過(guò)反向重復(fù)序列直接結(jié)合在pncrA上。在不結(jié)合Ni2+時(shí),NcrB通過(guò)與p1p17結(jié)合,阻止RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合,抑制了ncrA的表達(dá)。
　　 在ncrABCY操縱子上的另外兩個(gè)啟動(dòng)子pncrB和pncrY中都包含了與p1p17相似但不完整的反向重復(fù)序列,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明它們都不能與NcrB結(jié)合。