鉤端螺旋體表達譜的研究及噬菌體片段轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達研究.pdf

1、鉤端螺旋體簡稱鉤體，屬于螺旋體目(Spirochaetals)螺旋體科(Spirochaetaleae)鉤端螺旋體屬。其中致病性鉤體引起鉤體病(Leptospirosis)，此病人獸共患并呈全球分布。人通過直接或間接接觸感染動物的尿液而感染。鉤體病(Leptospirosis)l的臨床特點為高熱、頭痛、寒戰(zhàn)、乏力、淋巴結(jié)腫大和明顯的肌肉疼痛。重者可并發(fā)肺出血、黃疸、腦膜腦炎和腎功能衰竭等。由于缺乏有效的遺傳工具，對鉤端螺旋體的研究，尤其

2、對其致病機制的研究還相對較困難，因此對其致病機理的研究還不是很深入。 鉤端螺旋體的全基因組測序工作已于2002年完成，本實驗室于2004年根據(jù)注釋的ORFs設計了鉤端螺旋體的cDNA芯片。依據(jù)ORF注釋，對堿基序列>150bp的ORF設計特異引物，共設計3582個ORF，并以此PCR產(chǎn)物構(gòu)建芯片，每個點重復三次。鉤端螺旋體共注釋了4528個ORF，此基因芯片包含了全部注釋基因的79.1％。本試驗利用鉤端螺旋體的cDNA芯片，分別

3、研究了毒力株和減毒株，以及不同傳代的毒力株表達譜的差異。 鉤端螺旋體黃膽出血群賴型賴株毒力株[＃]56601(中賴)與鉤端螺旋體黃膽出血群賴型賴株減毒株(法賴)在遺傳背景上具有很大的相似性，但毒力卻有很大的差別。本試驗以37℃為試驗的培養(yǎng)條件，以體外37℃培養(yǎng)的鉤端螺旋體黃膽出血群賴型賴株毒力株[＃]56601(中賴)為測試株(tester)，以鉤端螺旋體黃膽出血群賴型賴株減毒株(法賴)為對照株(refenence)，利用鉤端螺

4、旋體的cDNA芯片測試了不同毒力株芯片表達譜的差異。結(jié)果表明在37℃培養(yǎng)條件下，毒力株和減毒株的表達譜具有明顯的差別。37℃培養(yǎng)時，毒力株中賴上調(diào)表達的基因有101個，下調(diào)表達的有71個。這些差異表達的基因在功能上可以分i0類。參照NCBI COGs功能分類，在上調(diào)表達的基因中，溶血素基因2個，脂蛋白基因2個，復制、轉(zhuǎn)錄及翻譯相關(guān)基因11個，防御機制相關(guān)基因2個，信號轉(zhuǎn)導及調(diào)控基因8個，膜蛋白基因及膜蛋白發(fā)生基因11個，細胞動力基因5個

5、，分泌基因2個，蛋白翻譯后修飾及折疊基因7個，新陳代謝相關(guān)基因29個，其它為功能未知蛋白基因。在下調(diào)表達的基因中，轉(zhuǎn)運及結(jié)合蛋白2個，復制、轉(zhuǎn)錄及翻譯相關(guān)基因21個，防御機制相關(guān)基因2個，信號轉(zhuǎn)導及調(diào)控基因6個，膜蛋白基因及膜蛋白發(fā)生基因4個，細胞動力基因1個，分泌基因2個，蛋白翻譯后修飾及折疊基因1個，新陳代謝相關(guān)基因16個，其它為功能未知蛋白基因。這些差異表達的基因可能在鉤端螺旋體毒力株致病方面發(fā)揮一定的作用。 致病性鉤端

6、螺旋體又可分為毒力株和減毒株。減毒株是由于鉤端螺旋體在體外傳代超過200次而導致的毒力大大減弱而造成的。很多研究認為鉤端螺旋體在體外傳代超過10次就會造成毒力的減弱，在傳代20次后鉤端螺旋體的形態(tài)就發(fā)生了較為明顯的變化，其一些生理學性質(zhì)也發(fā)生了明顯的改變。 為了能夠在全基因組水平上研究體外培養(yǎng)過程中引起鉤端螺旋體發(fā)生變化的分子機制，本試驗利用鉤端螺旋體的aDNA芯片研究了鉤端螺旋體在體外培養(yǎng)第一代與第五代、第十代及第二十代表達譜

7、的差異。從芯片的結(jié)果來看，中賴第一代和第五代及第一代和第十代相比差異表達基因分別為57個和80個，而第一代和第二十代相比差異表達的基因為270個。這一結(jié)果證實了鉤端螺旋體在體外傳代少于10次時，鉤端螺旋體未發(fā)生很明顯的毒力及其它方面的改變。而當體外傳代多于二十次后，鉤端螺旋體體內(nèi)發(fā)生了較為明顯的變化。變化較為明顯基因包括細胞膜及膜生成相關(guān)基因，信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因及細胞動力相關(guān)基因，這些發(fā)生明顯改變的基因可能與以前試驗所報道的細胞膜分子的變

8、化及細胞形態(tài)的變化及細胞的致病力有關(guān)。同時新陳代謝相關(guān)基因也發(fā)生了較為復雜的變化，這可能是鉤端螺旋體適應體外環(huán)境的結(jié)果。 同時在本試驗中第一代和第二十代的芯片結(jié)果中還有兩段共調(diào)控的基因，這一共調(diào)控的基因片段的功能還不是很清楚。在第三章我們將進一步研究其功能及其調(diào)控。 在很多細菌基因組中，都有噬菌體基因或者是噬菌體片斷的存在。噬菌體DNA作為重要的基因水平轉(zhuǎn)移載體，在致病菌的毒力進化過程中起著重要的作用。噬菌體作為細菌的一

9、個獨立存在的遺傳單位，既可以獨立于細菌染色體之外也可以整合于細菌染色體之上，所以成為研究細菌基因組學的一個重要遺傳工具。到目前為止，致病性鉤端螺旋體中一直沒有分離到噬菌體顆粒存在。本試驗首先用生物信息學方法，利用已知的噬菌體序列對LA01 83一LA0221片段做了BLAST分析(www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／)和蛋白保守區(qū)的分析(http：//pfam.wustl.edu/hmmsearch.shtml)。分析

10、表明在這一片段上，存在有較多的噬菌體同源序列，它們分別與整合酶基因、一噬菌體調(diào)控基因及噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白具有相似性。其中LA0195蛋白具有明顯的噬菌體調(diào)控蛋白CI蛋白保守域及DNA結(jié)合域。LA0184與整合酶有較低的相似性，LA0189與Mu噬菌體的gam蛋白有較高的相似性，LA0205、LA0211及LA0215均為類噬菌體結(jié)構(gòu)基因。本試驗從操縱子結(jié)構(gòu)、啟動子序列、及cI基因的功能對此片段做了研究。 運用RT-PCR技術(shù)，在相

11、鄰的基因之間跨相鄰基因設計PCR引物，共設計了覆蓋LA0183-LA0219的20對引物，做RT-PCR研究此片段的基因共轉(zhuǎn)錄。結(jié)果表明，此片段共包含5個轉(zhuǎn)錄子，從左到右依次為：LA0183-LA0185為正向共轉(zhuǎn)錄、LA0186-LA0194為反向共轉(zhuǎn)錄、LA0196-LA0197為反向共轉(zhuǎn)錄、LA0198-LA0202為正向共轉(zhuǎn)錄、LA0203-LA0219，為正向共轉(zhuǎn)錄。 由于LA0195為C／的同源蛋白。在多數(shù)噬菌體中，

12、CI蛋白主要結(jié)合在鄰近的特異DNA序列上以調(diào)控噬菌體基因表達。因此，我們首先對LA0195鄰近的序列做了生物信息學分析。第果表明，在LA0194基因與LA0195基因的基因間序列存在有一正向重復序列和一反向重復序列。由于啟動子序列上也有特異的DNA—binding域，我們運用http：//www.soflberry.com／berrv.phtml．軟件，對鄰近LA0195蛋白的LA0195、LA0194及LA0198基因的啟動子序列進行

13、了預測并把預測的序列克隆到啟動子載體pKK232-8中以進一步證實啟動子的活性。通過氯霉素篩選及CAT-ELLISA試驗，LA0195及LA0194啟動子在大腸桿菌中具有很強的啟動活性，而LA0198的啟動子沒有很明顯的啟動活性。 LA0194及LA0195啟動子均包含了LA0195與LA0194之間的重復序列。為了證明LA0195蛋白是否具有結(jié)合以上調(diào)控序列的功能，我們在體內(nèi)對LA0195蛋白進行了克隆表達和純化。為了測定LA

14、0195蛋白的結(jié)合能力，我們對LA0194、LA0195及LA0198的啟動子序列進行了生物素標記，用pierce公司的EMSA試劑盒在體外做了LA0195蛋白與啟動子的體外結(jié)合試驗，結(jié)果表明，LA0195蛋白與LA0194啟動子及LA0195啟動子均有結(jié)合活性。這說明LA0195蛋白在體內(nèi)還應具有一定的調(diào)控能力。 本試驗首次對鉤端螺旋體的類噬菌體序列做了研究。一般來講，噬菌體序列對宿主都有一定的貢獻，如在致病性及抗藥性方面起一