鉤端螺旋體感染的轉(zhuǎn)錄組學(xué)與鉤體結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、第一部分：鉤端螺旋體病(Leptospirosis，鉤體病)世界范圍內(nèi)廣泛分布的人畜共患病。問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體(Leptospira interrogans，問(wèn)號(hào)鉤體)是造成鉤體病的主要致病菌。最近研究表明，吞噬作用在宿主固有免疫系統(tǒng)抵抗鉤體感染中起到了重要作用，且問(wèn)號(hào)鉤體可以逃避吞噬細(xì)胞的殺傷作用。然而，該過(guò)程中問(wèn)號(hào)鉤體的宿主適應(yīng)性變化尚未可知。
　　 為了研究致病性鉤體與宿主固有免疫互作過(guò)程中的分子機(jī)理，我們采用高密度基因芯片和

2、比較基因組學(xué)方法研究了問(wèn)號(hào)鉤體賴型賴株56601在感染巨噬細(xì)胞系過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化。結(jié)果表明，問(wèn)號(hào)鉤體在接觸細(xì)胞過(guò)程中迅速調(diào)控了許多生化途徑的基因表達(dá)，涉及碳源代謝，能量產(chǎn)生，脂類代謝，信號(hào)傳導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄與翻譯，抗氧化，以及外膜蛋白等。含血紅素的過(guò)氧化氫酶基因(katE)顯著上調(diào)4-7倍，說(shuō)明該酶可能是對(duì)抗宿主氧化殺傷的的主要功能基因。另外，多個(gè)主要外膜蛋白的基因，如ompL1，lopL32，lipL41，lipL48，ompL47等，在

3、接觸巨噬細(xì)胞的過(guò)程中顯著下調(diào)10-50倍，這與先前動(dòng)物模型中分離鉤體的外膜蛋白定量研究結(jié)果一致。本研究進(jìn)一步用免疫雜交方法驗(yàn)證了這些外膜蛋白在蛋白水平的持續(xù)下調(diào)。最后，結(jié)合比較基因組和基因組更新注釋，本研究重新定義分類了鉤體轉(zhuǎn)錄因子基因家族，并發(fā)現(xiàn)OmpR家族主要轉(zhuǎn)錄因子基因LB333的表達(dá)與主要外膜蛋白基因協(xié)同調(diào)控，初步說(shuō)明該因子可能參與主要外膜蛋白的調(diào)控。
　　 本研究首次揭示了問(wèn)號(hào)鉤體應(yīng)對(duì)宿主固有免疫系統(tǒng)的全轉(zhuǎn)錄組變化，主

4、要結(jié)果與先前體外條件調(diào)控轉(zhuǎn)錄組的研究結(jié)果有顯著差異。問(wèn)號(hào)鉤體在接觸宿主抗原遞呈細(xì)胞(APCs)過(guò)程中顯著改變了外膜系統(tǒng)，這可能是重要的免疫逃逸機(jī)制，并為今后選擇亞單位疫苗靶點(diǎn)提供了重要參考信息。本研究重新定義了鉤體基因組中的轉(zhuǎn)錄因子基因，這為進(jìn)一步研究鉤體轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分：鉤端螺旋體病(Leptospirosis，鉤體病)是世界范圍內(nèi)廣泛存在的熱帶病，尤其在濕熱的熱帶和亞熱帶地區(qū)較為流行。致病性鉤端螺旋體(P

5、athogenicLeptospira)通過(guò)粘膜或者傷口感染宿主后，迅速進(jìn)入血流并擴(kuò)散到肺，肝，腎和其他組織器官。不同致病性鉤體感染宿主的臨床癥狀復(fù)雜，包括眼結(jié)膜充血，腹瀉，黃疸，腎衰和腦膜炎等。強(qiáng)致病性鉤體，如問(wèn)號(hào)鉤體(Leptospira interrogans)等，所造成急性感染能導(dǎo)致嚴(yán)重的器官損傷。其中嚴(yán)重肺出血的致死率高達(dá)15％。
　　 近幾年，固有免疫系統(tǒng)被證實(shí)在鉤體急性感染中起到了重要作用。致病性鉤體能夠逃避宿主巨

6、噬細(xì)胞的吞噬，且誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡。巨噬細(xì)胞作為固有免疫系統(tǒng)中主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞之一，在吞噬和殺滅，抗原遞呈以及免疫調(diào)節(jié)等方面起到了重要作用。問(wèn)號(hào)鉤體感染鼠類和人后，僅可以在人源巨噬細(xì)胞中存活并繁殖，這可能與問(wèn)號(hào)鉤體慢性感染鼠類和急性感染人類后不同的臨床癥狀呈正相關(guān)。目前研究致病性鉤體與宿主巨噬細(xì)胞互作的分子機(jī)制研究?jī)H停留在個(gè)別基因或者信號(hào)通路上，缺少全局性認(rèn)識(shí)。
　　 本研究采用本論文第一部分的鉤體感染巨噬細(xì)胞系模型和全轉(zhuǎn)錄組基

7、因芯片技術(shù)，結(jié)合GO和KEGG基因功能和分類數(shù)據(jù)庫(kù)，初步揭示了問(wèn)號(hào)鉤體賴型賴株56601感染鼠源和人源巨噬細(xì)胞系后基因轉(zhuǎn)錄水平的整體差異。通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)兩類細(xì)胞在炎癥因子和趨化因子表達(dá)上存在較大差異；人源巨噬細(xì)胞系的抗原遞呈途徑基因受調(diào)控幅度明顯小于鼠源細(xì)胞；發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體途徑中處于核心地位的C3組分在鼠源細(xì)胞中顯著上調(diào)，這可能有助于鼠類宿主感染初期的補(bǔ)體激活；凋亡途徑中，CASP8凋亡調(diào)控基因的顯著上調(diào)，這與本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的問(wèn)號(hào)

8、鉤體通過(guò)caspase-8和caspase-3通路誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的結(jié)論一致。
　　 鉤體病臨床癥狀多樣，致病型鉤體菌體物質(zhì)成分復(fù)雜，這都決定了鉤體感染研究是一項(xiàng)任重道遠(yuǎn)的工作。本研究通過(guò)高通量基因表達(dá)譜篩選和生物途徑統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)了一些鉤體感染鼠源和人源巨噬細(xì)胞系后表達(dá)水平的差異，為進(jìn)一步深入研究鉤體感染的固有免疫機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三部分：雙曲鉤端螺旋體(Leptospira biflexa)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)較伯

9、氏疏螺旋體(Borreliaburgdoriferi)更為復(fù)雜，主要表現(xiàn)為基因組較大，編碼100多個(gè)特異性轉(zhuǎn)錄因子(specific TF)。雙曲鉤體沒(méi)有非特異性Sigma S(RpoS)轉(zhuǎn)錄因子，所以Sigma N(Sigma54，RpoN)轉(zhuǎn)錄因子可能在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起到了更大的作用。但由于鉤體特異性轉(zhuǎn)錄因子較多，鉤體RpoN在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用可能與伯氏疏螺旋體的RpoN大不相同。
　　 本研究采用同源重組基因敲除的方法，定點(diǎn)失

10、活了雙曲鉤體的RpoN轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)一步采用全轉(zhuǎn)錄組基因芯片技術(shù)檢測(cè)了該轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控靶點(diǎn)。雙曲鉤體RpoN的調(diào)控靶點(diǎn)主要是氮源代謝相關(guān)基因，與模式生物大腸桿菌相似。野生株和突變體的培養(yǎng)物中吐溫-80成分的消耗量差異顯著，突變體的消耗量大幅度減少。通過(guò)Cryo-ET分子電鏡結(jié)構(gòu)分析和尼羅紅染色，發(fā)現(xiàn)雙曲鉤體RpoN突變體已經(jīng)不再形成聚beta-羥基丁酸(PHB)貯藏物。這可能與RpoN正調(diào)控氨攝取基因有關(guān)。另外，RpoN突變體在純水中的死

11、亡速度明顯快于野生株。
　　 本研究是鉤端螺旋體上第一項(xiàng)定點(diǎn)敲除轉(zhuǎn)錄因子研究其調(diào)控機(jī)理的分子細(xì)菌學(xué)研究。雙曲鉤體RpoN突變體喪失了合成貯藏物的能力，并且在純水中的生存能力也明顯下降。這說(shuō)明RpoN轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于雙曲鉤體在無(wú)養(yǎng)料條件下的耐受能力至關(guān)重要的?？紤]到問(wèn)號(hào)鉤體與雙曲鉤體的Sigma非特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)基本相同，可以推測(cè)問(wèn)號(hào)鉤體的RpoN也是正調(diào)控其體外生長(zhǎng)傳播能力的主要因子。
　　 第四部分：鉤體病(Leptos

12、pirosis)是世界范圍內(nèi)廣泛分布的人畜共患病。問(wèn)號(hào)鉤體(Leptospira interrogans)是造成該傳染病的主要致病菌。目前，致病性鉤體仍然缺乏有效的基因操作手段，且其結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究尚未開(kāi)展，所以該致病菌的分子生物學(xué)特性和該全球性公共疾病的致病機(jī)理尚不明了。本研究采用低溫電鏡技術(shù)(Cryo-electron tomography，Cryo-ET)比較分析致病性問(wèn)號(hào)鉤體和腐生性雙曲鉤體的精細(xì)結(jié)構(gòu)，揭示了鉤體的一些生物學(xué)新特性

13、和可能的致病機(jī)理。問(wèn)號(hào)與雙曲鉤體的主要區(qū)別是兩者有不同含量的LPS成分。這初步證明了鉤體LPS含量在不同血清型之間差別很大的推論。鉤體獨(dú)特的胞質(zhì)纖維成分可能是決定鉤體特有的螺旋狀形態(tài)的骨架。冰凍活鉤體的DNA成分在柱狀細(xì)胞內(nèi)呈緊密束狀存在，折疊的間隙約為3.3nm。另外，本研究也揭示了雙曲鉤體特有的甲基接收蛋白結(jié)構(gòu)，鉤體特有的頂端“帽子”結(jié)構(gòu)，和鉤體鞭毛馬達(dá)的高精細(xì)結(jié)構(gòu)。這些新發(fā)現(xiàn)不僅闡明了鉤體的獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，也為研究鉤體與宿主互作