問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體鞭毛相關(guān)基因的克隆表達(dá)與功能的初步研究.pdf

1、本文分兩部分，第一部分：?jiǎn)柼?hào)鉤端螺鉤體鞭毛相關(guān)基因原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建和膜定位
　　 背景和目的：鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)病是由致病性鉤體引起的全世界流行的人獸共患病，鉤體的攜帶者主要是野生動(dòng)物或家畜，尤其是嚙齒動(dòng)物、有袋動(dòng)物、牛、豬和狗。人感染鉤體后的臨床癥狀從輕微的癥狀到多器官衰竭，以黃疸、肺出血和腎衰竭為主要特征。肺彌漫性出血是一癥狀嚴(yán)重的的鉤體病，病死率高達(dá)25％。相反，大多數(shù)鉤體哺乳宿主動(dòng)物如嚙齒類動(dòng)物只呈現(xiàn)輕微的慢性疾病

2、或無(wú)癥狀感染，且通過(guò)尿液向外界終身排菌，造成此不同感染結(jié)局的差異至今還不清楚。鉤體病的致病因素如：脂多糖、脂蛋白、肽聚糖、熱休克蛋白及鞭毛蛋白等可能與致病性有關(guān)，但確切的致病機(jī)制至今未明。已知不少病原菌主要通過(guò)Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)作用于宿主細(xì)胞，諸如黏附細(xì)胞、形成針形結(jié)構(gòu)向胞內(nèi)注入毒力因子、干擾及損傷細(xì)胞等。有文獻(xiàn)報(bào)道，鞭毛結(jié)構(gòu)蛋白也經(jīng)T3SS分泌，某些鞭毛相關(guān)蛋白則是T3SS家族成員.近年發(fā)現(xiàn)問(wèn)號(hào)鉤體具有較為完整的鞭毛組裝系統(tǒng)，相

3、關(guān)蛋白編碼基因連續(xù)排列在大染色體中形成毒力島樣結(jié)構(gòu)，其中鞭毛相關(guān)蛋白FliH、Flil、FliN和FliY等與鼠疫耶爾森菌T3SS的Ysc蛋白高度同源。因此，上述鞭毛相關(guān)蛋白在問(wèn)號(hào)鉤體致病過(guò)程中的作用是有待于研究的重要課題。
　　 方法：以苯酚-氯仿法提取的問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株基因組DNA為模板，用PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)fliH、fil、fliN和fliY基因片段，T-A克隆后測(cè)序，繼而構(gòu)建上述目的基因克隆的原核表達(dá)系統(tǒng)。采用SD

4、S-PAGE和BioRad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢查重組蛋白rFliH、rFlil、rFliN和rFliY的表達(dá)情況，Ni-NTA親和層析法提純目的表達(dá)產(chǎn)物。皮下免疫家兔獲得4種目的重組蛋白抗血清，用ELISA和Western Blot分別檢測(cè)抗血清效價(jià)并了解抗血清與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力.采用免疫電鏡技術(shù)對(duì)FliH、Flil、FliN和FliY進(jìn)行定位。
　　 結(jié)果：PCR擴(kuò)增獲得大小分別為924、1365、318和1065bp的全長(zhǎng)j

5、liH、fliI、fliN和fliY基因片段，與報(bào)道的序列比較，其核苷酸和氨基酸序列相似性均為100％。所構(gòu)建的原核表達(dá)系統(tǒng)均能有效地表達(dá)目的重組蛋白，其產(chǎn)量均約為20％。rFliH、rFliI、rFliN和rFliY蛋白免疫家兔后能產(chǎn)生抗體，其兔抗血清ELISA效價(jià)達(dá)到1：100000以上，并分別能識(shí)別相應(yīng)重組蛋白而出現(xiàn)明顯的Westem雜交條帶。FliH、FliI、FliN和FliY蛋白分布于問(wèn)號(hào)鉤體內(nèi)膜外表面、外膜內(nèi)表面或內(nèi)外膜之

6、間。
　　 結(jié)論：本研究成功地構(gòu)建了能高效表達(dá)問(wèn)號(hào)鉤體鞭毛相關(guān)蛋白FliH、FliI、FliN和FliY的原核表達(dá)系統(tǒng)，并獲得了能有效識(shí)別上述蛋白抗原的高效價(jià)抗血清。鞭毛相關(guān)蛋白FliH、Flil、FliN和FliY是問(wèn)號(hào)鉤體內(nèi)膜或外膜蛋白成分。
　　 第二部分：應(yīng)用基因打靶技術(shù)構(gòu)建問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體fliH/I/N/Y基因突變體及其功能的初探
　　 背景和目的：鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)病是全世界流行的人獸共患病，致病

7、性鉤體侵入人體后能引起急性發(fā)熱和全身各系統(tǒng)的疾病。鉤體病的致病因素如：脂多糖、脂蛋白、肽聚糖、熱休克蛋白及鞭毛蛋白等可能與致病性有關(guān)，但確切的致病機(jī)制至今未明。FliN和FliY都被注釋為鞭毛馬達(dá)開(kāi)關(guān)蛋白，和鼠疫耶爾森菌yscQ基因有一定的相似性，且YscQ屬于耶爾森菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)，與細(xì)菌侵襲力相關(guān)，也與鞭毛的轉(zhuǎn)向相關(guān)。因此我們將FliN和FliY作為鉤體毒力研究的重點(diǎn)對(duì)象。而fliH注釋為鞭毛合成蛋白，與鼠疫耶爾森菌yscL基因的氨基

8、酸序列相似度很高，fliI與鼠疫耶爾森菌yscN基因同屬于ATP酶，耶爾森菌中YscL蛋白負(fù)調(diào)控YscN的ATPase的活性。因此我們希望通過(guò)研究FliH和FliI的關(guān)系，從而對(duì)該兩者的功能有初步的了解。
　　 方法：本研究通過(guò)插入amp基因構(gòu)建重組的基因打靶載體，經(jīng)電穿孔導(dǎo)入鉤體內(nèi)構(gòu)建突變體.用氨芐青霉素抗性、PCR法和Western blot鑒定突變株。針對(duì)FliN—、FliY_突變株，動(dòng)力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了突變株的運(yùn)動(dòng)能力；Fon

9、tana銀染法檢測(cè)了突變株的粘附能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了突變株和野生株的感染不同時(shí)間后的小鼠巨噬細(xì)胞的死亡情況；豚鼠攻擊實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了突變株和野生株的毒力。Machite green assay檢測(cè)了FliI的ATPase活性和FliH與FliI的相互作用，而實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR則檢測(cè)了FliH與FliI在FliH-突變株和野生株間表達(dá)情況的變化。
　　 結(jié)果：分別以FliH-、Flil、FliN-、FliY-突變株的DNA為模板

10、，經(jīng)PCR擴(kuò)增均得到較原基因片段長(zhǎng)954bp的片段，此即為插入amp基因的長(zhǎng)度；同時(shí)突變株的Western blot結(jié)果也分別得到了FliH、FliI、FliN、FliY表達(dá)的陰性結(jié)果。由此證實(shí)分別構(gòu)建成功了以氨芐青霉素抗性基因(amp)為標(biāo)記fliH、fliI、fliN和fliY基因敲除的鉤體突變株。FliN-、FliY-突變株的菌落比野生株的明顯小，表明失去運(yùn)動(dòng)能力。FliN-、FliY-突變株和野生株對(duì)J774A.1細(xì)胞的最大黏附

11、率分別為25.5％、22.9％和49.1％；三者誘導(dǎo)J774A.1細(xì)胞的最大凋亡率分別為29.7％、27.4％和48.2％。而豚鼠攻擊的致死劑量突變株也同樣明顯高于野生株，當(dāng)注入6×109個(gè)野生株鉤體時(shí)，死亡率達(dá)到100％；當(dāng)分別注入6×1010個(gè)FliN-、FliY-突變株鉤體時(shí)，死亡率才達(dá)到80％和60％.實(shí)驗(yàn)證明了FliI的ATPase活性和FliH對(duì)FliI ATPase活性的抑制作用，在FliH—突變株中FliI的表達(dá)相較于野