問號鉤端螺旋體主要外膜蛋白免疫功能表位及其致炎作用的研究.pdf

1、鉤端螺旋體(簡稱鉤體)病是由問號鉤體感染引起的自然疫源性人獸共患傳染病，人類主要通過接觸帶菌動(dòng)物尿液污染的水體、土壤而感染。因此鉤體病也是洪澇時(shí)重點(diǎn)監(jiān)控的傳染病。嚴(yán)重者可導(dǎo)致Weil's綜合癥。雖然鉤體病的致病因素如：脂多糖、脂蛋白、肽聚糖、熱休克蛋白及鞭毛蛋白等可能與致病性有關(guān)，但確切的致病機(jī)制至今未明。 鉤端螺旋體屬可分為問號鉤體和雙曲鉤體，前者為致病菌，后者則為腐生型。鉤體血清群、型眾多，各群、型間交叉保護(hù)作用較弱或無，故

2、目前國內(nèi)外均采用當(dāng)?shù)亓餍械你^體血清群、型來制備多價(jià)鉤體疫苗菌苗，但副作用較大，交叉免疫保護(hù)作用微弱。 近年我國科學(xué)家報(bào)道了問號鉤體黃疸出血群賴型賴株的全基因序列，國外學(xué)者報(bào)告跨膜蛋白OmpL1、脂蛋白LipL32和LipL41是所有問號鉤體外膜中主要的表面蛋白。我們曾證實(shí)我國流行的問號鉤體參考標(biāo)準(zhǔn)株均含有編碼上述外膜蛋白的ompL1、lipL32和lipL41基因，其重組表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性和免疫反應(yīng)性。然而，OmpL1、L

3、ipL32和LipL41可能的抗原表位，及其誘導(dǎo)細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的作用未見報(bào)道。 本研究中，我們建立了Ni-NTA親和層析法，并提取了不同基因型表達(dá)的重組目的蛋白(rOmpL1/1和rOmpL1/2、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2)，以SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物，采用多種預(yù)測服務(wù)器對表達(dá)產(chǎn)物分子的功能表位進(jìn)行了分析，并以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EVC-304為效應(yīng)細(xì)胞，檢測了上述重

4、組蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的作用。 1材料和方法1.菌株和細(xì)胞株：問號鉤體ompL1/1和ompL1/2、lipL32/1和lipL32/2、lipL41/1和lipL41/2基因型原核表達(dá)系統(tǒng)由本實(shí)驗(yàn)室提供。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EVC-304購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的RPMI1640。 2.目的蛋白的表達(dá)和鑒定：將上述工程菌株接種于BL培養(yǎng)基中，30℃300r/min振蕩培養(yǎng)至OD

5、600為0.6～0.8，加入0.25mmol/LIPTG，30℃300r/min振蕩培養(yǎng)約4h，誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)目的重組蛋白。10000r/min離心15min收集細(xì)菌沉淀，用滅菌蒸餾水重懸，300V、5S×5超聲破碎。利用表達(dá)產(chǎn)物中6×His標(biāo)簽，以Ni-NTA親和層析柱(Biocolor)收集并純化目的蛋白。采用10％SDS-PAGE檢測目的蛋白表達(dá)和提純情況。 3.信號肽、MHC-Ⅱ類分子結(jié)合肽和B細(xì)胞表位分析：蛋白質(zhì)一級序列

6、由本實(shí)驗(yàn)室提供。信號肽分析采用TechnicaluniversityofDenmarkdtu提供的預(yù)測服務(wù)器SignalP3.0版本SignalP-NN軟件，MHC-Ⅱ類分子結(jié)合肽和B細(xì)胞表位分析分別采用InstituteofMicrobialToechnology,Chandigarh,India提供的預(yù)測服務(wù)器PropredMHCclass-Ⅱbindingpeptideprediction-ProPred和EMBOSS軟件包中AN

7、TIGENIC程序。 4.炎性細(xì)胞因子的檢測：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入5×103個(gè)EVC-304細(xì)胞，在5％CO2、37℃條件下預(yù)培養(yǎng)24h。分別用2％胎牛血清RPMI1640配制的不同濃度rOmpL1/1和OmpL1/2、LipL32/1和rLipL32/2、LipL41/1和rLipL41/2溶液換液，使上述6種重組蛋白的終濃度分別為每孔1和10μg，各重組蛋白的不同作用濃度均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)板于5％CO2、37℃條件下

8、分別培養(yǎng)24和48h。收集上清液，用ELISA檢測試劑盒(TPI)按操作說明書分別檢測IL-1α、IL-8和TNF-α的OD490值。試驗(yàn)中分別以每孔0.1μg的重組TNF-α商品(SibEnzyme)和2％胎牛血清的RPMI1640為陽性對照和陰性對照。根據(jù)試劑盒所提供的IL-1α、2IL-8和TNFα標(biāo)準(zhǔn)品及操作說明書，以O(shè)D490值為縱坐標(biāo)、各細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用Excel軟件獲得各細(xì)胞因子濃度計(jì)算公式。

9、 5.數(shù)據(jù)分析：采用SPSS9.0軟件，對OmpL1/1和OmpL1/2、LipL32/1和LipL32/2、LipL41/1和LipL41/2誘導(dǎo)EVC-304細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的檢測結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。結(jié)果1.信號肽序列及切割位點(diǎn)：OmpL1s、LipL32s和LipL41s的N端1～21或1～24位氨基酸構(gòu)成信號肽，切割位點(diǎn)在N端的第21～22或24～25位。 2.MHC-Ⅱ類分子結(jié)合肽和B細(xì)胞表位：OmpL1s

10、、LipL32s和LipL41s能與半數(shù)以上目前已知51個(gè)MHC-Ⅱ等位基因的結(jié)合肽段分別有3、3和1個(gè)，但同時(shí)與B細(xì)胞結(jié)合的重疊表位分別為3、2和1個(gè)。 3.目的蛋白的表達(dá)產(chǎn)量及產(chǎn)物純度：SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，rOmpL1/1和rOmpL1/2、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2的表達(dá)產(chǎn)量分別約占細(xì)菌總蛋白的30％和15％、40％和35％、15％和10％，經(jīng)Ni-NTA親和層

11、析法提取的目的蛋白SDS-PAGE后均僅見單一的蛋白條帶。 4.OmpL1s、LipL32s和LipL41s誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的作用：IL-1α、IL-8和TNFα濃度計(jì)算公式分別為yIL-1α=46.51X-6.32、yIL-8=42.46X-3.50和yTNFα=362.64X-24.79。1和10μg的OmpL1s、LipL32s和LipL41s均可明顯促進(jìn)人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EVC-304合成并分泌IL-1α、IL

12、-8和TNF-α(P＜0.05)，且同一基因不同基因型表達(dá)產(chǎn)物作用效果相似(P＞0.05)。其中IL-1α以作用24h時(shí)最高，然后下降；IL-8和TNF-α則隨作用時(shí)間延長而3逐漸升高。上述不同基因產(chǎn)物中，誘導(dǎo)細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子活性強(qiáng)弱依次為OmpL1s、LipL41s和LipL32s。 結(jié)論1.本研究表明ompL1/1和ompL1/2、lipL32/1和lipL32/2、lipL41/1和lipL41/2基因型原核表達(dá)系統(tǒng)是

13、高效原核表達(dá)系統(tǒng)； 2.建立了可快速獲得高純度目的重組蛋白的Ni-NTA親和層析法； 3.問號鉤體ompL1/1、lipL32或lipL41不同基因型的表達(dá)產(chǎn)物均存在相似的MHC-Ⅱ類分子結(jié)合肽和B細(xì)胞表位； 4.建立了鉤體主要外膜蛋白對靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的致炎模型； 5.rOmpL1/1和OmpL1/2、LipL32/1和rLipL32/2、LipL41/1和rLipL41/2對EVC-304細(xì)胞均有直接的致