不同類型細(xì)胞內(nèi)吞問號鉤端螺旋體機(jī)制差異性研究.pdf

1、背景及目的意義:鉤體病是全世界流行的人獸共患傳染病，由問號鉤端螺旋體（Leptospira interrogans，簡稱鉤體）感染引起。鉤體通過粘膜及皮膚入侵動物體內(nèi)，通過血液散播至全身各個器官，如肝，肺和腎。在亞洲，歐洲和美洲，鉤體病常被報道[2-4]。在鉤體感染哺乳動物過程中，不同種類的細(xì)胞發(fā)揮不同的功能。吞噬細(xì)胞能吞噬并降解鉤體，保護(hù)動物體免受鉤體及其他外來病原微生物。鉤體在動物體內(nèi)傳播過程中，血管細(xì)胞可通過跨膜運(yùn)輸?shù)姆绞綄^體從

2、血液運(yùn)送到靶器官（靶器官到血液）的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，鉤體的活力無明顯變化。本研究的目的是研究不同細(xì)胞對鉤體的內(nèi)吞機(jī)制的差異性，對今后我們更深入認(rèn)識鉤體在體內(nèi)的傳播途徑及運(yùn)輸機(jī)制，為我們進(jìn)一步開發(fā)藥物，探索新的治療方法奠定堅實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 研究方法:本研究采用THP-1(人單核細(xì)胞株)、J774A.1（小鼠單核-巨噬樣細(xì)胞）、HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)為研究材料，研究不同細(xì)胞在內(nèi)吞鉤體過程中的機(jī)制性差異。ELISA法檢

3、測鉤體與ECM分子（FN、LN、COL1、COL2、COL3和COL4）的粘附及粘附抑制;激光共聚焦顯微鏡和ELISA法檢測三種細(xì)胞的表面ECM分子（FN、LN、COL1、COL2、COL3和COL4）的表達(dá);透射電子顯微鏡觀察三種細(xì)胞對鉤體的內(nèi)吞機(jī)制;流式細(xì)胞法及western-blot檢測三種細(xì)胞表面ITGB1、ITGB2、ITGB3和CAV-1的表達(dá);western-blot法檢測三種細(xì)胞內(nèi)吞泡表面ITGB1、ITGB2、ITGB

4、3和CAV-1的分布;抗體封閉和siRNA沉默三種細(xì)胞ITGB1、ITGB2和ITGB3，filipin阻斷三種細(xì)胞小窩，siRNA沉默HUVEC的CAV-1，鉤體感染各處理細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)鉤體熒光強(qiáng)度的變化;三種細(xì)胞內(nèi)吞鉤體前后FAK及PI3K磷酸化的變化;FAK及PI3K抑制劑處理三種細(xì)胞，鉤體感染各處理細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)鉤體熒光強(qiáng)度的變化;激光共聚焦顯微鏡觀察鉤體感染三種細(xì)胞前后，微絲和微管的變化;微

5、絲和微管抑制劑處理三種細(xì)胞，鉤體感染各處理細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)鉤體熒光強(qiáng)度的變化;激光共聚焦3D重建細(xì)胞Z軸，觀察HUVEC內(nèi)吞鉤體的情況;ITGB1、ITGB2、ITGB3抗體封閉及filipin阻斷前后，鉤體感染HUVEC，transwell檢測細(xì)胞雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)鉤體情況;鉤體與CAV-1的共定位;鉤體感染三種細(xì)胞，鉤體與溶酶體及鉤體的共定位;鉤體被三種細(xì)胞內(nèi)吞，細(xì)胞內(nèi)鉤體的生長活力。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

6、，鉤體可以與FN、LN、COL1、COL2、COL3和COL4等ECM分子粘附;激光共聚焦顯微鏡顯示THP-1和J774A.1表面有FN分布，HUVEC表面有FN、LN、COL3和COL4分布，其中每個THP-1細(xì)胞表面有4.2×107個FN分子，每個J774A.1細(xì)胞表面有3.8×107個FN分布，每個HUVEC表面分別有1.543×107，1.23×106，2.73×106和3.14×106個FN、LN、COL3和COL4分布;透射

7、電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)三種細(xì)胞均能對鉤體內(nèi)吞;流式細(xì)胞法及western-blot檢測發(fā)現(xiàn)THP-1和J774A.1表面有ITGB1、ITGB2和ITGB3分布，HUVEC表面有ITGB1、ITGB3和CAV-1分布;THP-1和J774A.1內(nèi)吞泡表面有ITGB1分布，HUVEC表面有ITGB1和CAV-1分布;三種細(xì)胞被ITGB1抗體封閉和siRNA沉默，鉤體感染細(xì)胞后，激光共聚焦發(fā)現(xiàn)THP-1、J774A.1和HUVEC細(xì)胞內(nèi)吞鉤體數(shù)

8、量顯著降低;HUVEC被filipin阻斷（小窩抑制劑）或siRNA沉默CAV-1，鉤體感染細(xì)胞，激光共聚焦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)吞鉤體數(shù)量顯著降低;THP-1和J774A.1被鉤體感染后，F(xiàn)AK磷酸化顯著升高，PI3K磷酸化無顯著變化，HUVEC被鉤體感染后，PI3K磷酸化顯著升高，F(xiàn)AK磷酸化無顯著變化;鉤體感染被FAK抑制劑處理THP-1、J774A.1，胞內(nèi)鉤體顯著降低，鉤體感染被PI3K抑制劑處理的HUVEC，胞內(nèi)鉤體顯著降低;鉤體感染三

9、種細(xì)胞后，微絲發(fā)生聚集，微管無變化;微絲抑制劑作用三種細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)吞鉤體能力顯著降低，微管抑制劑作用三種細(xì)胞無此作用;激光共聚焦3D重建細(xì)胞Z軸顯示鉤體可以被HUVEC內(nèi)吞;用Transwell模型研究HUVEC對鉤體的跨膜運(yùn)輸，試驗(yàn)結(jié)果顯示，HUVEC被ITGB1抗體封閉、filipin處理后，細(xì)胞跨膜運(yùn)輸鉤體的能力顯著下降;鉤體在三種細(xì)胞中的活力存在差異，鉤體感染三種細(xì)胞，THP-1、J774A.1內(nèi)鉤體與溶酶體共定位，HUVEC

10、內(nèi)鉤體不與溶酶體共定位，導(dǎo)致鉤體被THP-1、J774A.1吞噬后，鉤體生長活力顯著降低于被HUVEC內(nèi)吞的鉤體;鉤體感染HUVEC后，鉤體與CAV-1共定位。
　　 結(jié)論:鉤體能與細(xì)胞表面ECM分子粘附;THP-1、J774A.1和HUVEC均能內(nèi)吞鉤體;THP-1和J774A.1吞噬鉤體由ITGB1、FAK和微絲介導(dǎo)，HUVEC內(nèi)吞鉤體由ITGB1、CAV-1、PI3K和微絲介導(dǎo);HUVEC可以對鉤體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，ITGB1和C