Paenibacillus polymyxa JSa-9抗菌肽高產(chǎn)菌選育及突變株表達(dá)差異分析.pdf

1、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)能代謝產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì)，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒的功能，能夠防治多種植物病害。其中，LI-F類抗菌脂肽是一種天然的廣譜抗菌物質(zhì)，由于其具有安全、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用潛力巨大。然而，野生型菌種的產(chǎn)量很低，使生產(chǎn)成本增加，導(dǎo)致LI-F類脂肽不能大規(guī)模生產(chǎn)，從而限制了其工業(yè)化應(yīng)用。
　　本研究以多粘類芽孢桿菌JSa-9為出發(fā)菌株，采用多種選育方式提高其產(chǎn)

2、LI-F類抗菌脂肽的能力，以期得到性質(zhì)穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株，為今后其工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要研究成果如下:
　　1.采用制備液相方法對(duì)多粘類芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)LI-F抗菌脂肽建立定量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。通過制備液相色譜得到脂肽LI-F的純品，純度在93％以上。脂肽LI-F檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=3401x-280.9，其線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9991，通過計(jì)算得知多粘類芽孢桿菌JSa-9發(fā)酵液中LI-F類抗菌脂肽的產(chǎn)量為88.19mg/L。

3、r>　　2.通過物理和化學(xué)方法對(duì)多粘類芽孢桿菌JSa-9誘變選育，獲得高產(chǎn)LI-F類抗菌脂肽的營養(yǎng)缺陷型菌株。分別采用亞硝基胍、60Co-γ射線和低能氮離子束注入三種誘變方法對(duì)其進(jìn)行誘變處理，通過致死率和正突變率統(tǒng)計(jì)，確定NTG最佳誘變濃度為50μg/mL;60Co-γ射線的最優(yōu)輻照劑量為200Gy;低能氮離子束最佳注入劑量為20keV，注入時(shí)間30s。經(jīng)過點(diǎn)植對(duì)照法和生長譜法篩選鑒定，得到了兩株?duì)I養(yǎng)缺陷型菌株N1-37和N2-27，分

4、別為苯丙氨酸缺陷型和組氨酸缺陷型。與野生菌株相比，N1-37和N2-27菌株的發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性分別提高了45.54％和32.35％，對(duì)串珠鐮孢菌的抑菌活性分別提高了23.12％和21.85％，對(duì)尖鐮孢菌的抑菌活性分別提高了18.08％和15.59％。N1-37和N2-27的脂肽LI-F產(chǎn)量分別是野生菌JSa-9的1.71倍和1.4倍。
　　3.對(duì)營養(yǎng)缺陷型菌株N1-37和N2-27進(jìn)行原生質(zhì)體融合技術(shù)研究。制備原生

5、質(zhì)體的最佳條件為:對(duì)數(shù)期種子液經(jīng)過二次轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)8h收集菌體;溶菌酶濃度為0.1mg/mL;酶解溫度37℃;酶解時(shí)間7min;酶解后原生質(zhì)體形成率均達(dá)到了97％以上，再生率均大于30％。PEG6000誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的最佳條件:PEG6000濃度為40％，pH值為9.0，融合時(shí)間為15 min。經(jīng)過篩選獲得一株高產(chǎn)融合子F5-15。通過測(cè)定其發(fā)酵液其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性提高了84.70％，對(duì)串珠鐮孢菌抑菌活性提高了49.32％，

6、對(duì)尖鐮孢菌的抑菌活性提高了38.96％。產(chǎn)LI-F類抗菌脂肽的產(chǎn)量為野生菌的3.1倍。
　　4.以原始菌株JSa-9為對(duì)照，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)融合子F5-15的LI-F類抗菌脂肽合成酶基因fus A1、fus A2、fusC1和fus C2的表達(dá)進(jìn)行分析。首先采用Trizol法提取得到RNA，測(cè)定其R值為1.93，說明所提RNA純度較高。之后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，以16S rDNA作為內(nèi)參基因，通過實(shí)時(shí)熒