產(chǎn)抗菌肽乳源乳酸菌的篩選及定向培養(yǎng).pdf

1、抗菌肽具有分子質(zhì)量小、熱穩(wěn)定性好、抗菌機(jī)理獨(dú)特、抗菌譜廣等特點(diǎn)，且相對(duì)于抗生素具有高效、無(wú)殘留和不產(chǎn)生耐藥性等顯著優(yōu)點(diǎn)。乳源乳酸菌產(chǎn)生的抗菌肽是一種廣譜、高效、穩(wěn)定、安全的天然抗菌物質(zhì)，已成為當(dāng)今國(guó)際研究的主要方向。目前抗菌肽主要應(yīng)用于奶牛乳房炎防治、治療仔豬腹瀉、促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)、飼料添加、食品防腐等方面。國(guó)內(nèi)迄今尚未系統(tǒng)地對(duì)乳源乳酸菌進(jìn)行抗菌肽篩選，也未確定高產(chǎn)抗菌肽的乳酸菌及培養(yǎng)方法。
　　 本研究根據(jù)抗菌肽作用機(jī)理，確定產(chǎn)抗

2、菌肽的乳源乳酸菌菌株，建立乳源乳酸菌高產(chǎn)抗菌肽定向培養(yǎng)技術(shù)，構(gòu)建高表達(dá)抗菌肽的乳酸菌培養(yǎng)新模式。并初步驗(yàn)證了乳源乳酸菌產(chǎn)抗菌肽對(duì)原奶的抑菌作用，為抗菌肽的理論研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用牛津杯法，對(duì)德氏乳桿菌保加利亞亞種、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、腸膜明串珠菌和乳酸乳球菌亞種進(jìn)行分離、培養(yǎng)，篩選出抑菌活性強(qiáng)的菌種2種，分別為嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌，并利用分離培養(yǎng)、鏡檢等常規(guī)方法以及16S rDNA分析、blast

3、分析和特異性引物PCR等技術(shù)對(duì)所選菌株進(jìn)行鑒定。以抑菌效果作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過改變培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分及環(huán)境條件，確立乳酸乳源菌產(chǎn)抗菌肽的定向培養(yǎng)方法，然后通過正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行最佳培養(yǎng)條件的優(yōu)化。最后將抗菌肽產(chǎn)量明顯的菌株應(yīng)用于牛奶保鮮實(shí)驗(yàn)，觀察評(píng)價(jià)其對(duì)牛奶保鮮的效果。試驗(yàn)結(jié)果表明：①?gòu)?種乳源乳酸菌中篩選得出嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌具有較強(qiáng)的抑菌活性；②蛋白酶活性試驗(yàn)說明抑菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)類物質(zhì)；③經(jīng)生理生化鑒定及特異性引物PCR分析確定為嗜酸乳桿菌

4、和干酪乳桿菌；④正交實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌最佳營(yíng)養(yǎng)環(huán)境為：蔗糖3％、牛肉膏4％、NaCl0.5％、Tween-801.5％，起始pH為5.0；干酪乳桿菌最佳營(yíng)養(yǎng)環(huán)境為：蔗糖1％、大豆蛋白胨3％、NaCl0.7％、Tween-801.0％，起始pH為6.0；⑤將嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌分別與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行共培養(yǎng)，經(jīng)24h、48h、72h、96h、120h作用后抑菌活性顯著提高，在培養(yǎng)120h后，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌幾

5、乎全部被抑制；⑥經(jīng)添加代謝前體物、調(diào)節(jié)起始pH、培養(yǎng)溫度及拮抗作用等定向培養(yǎng)方式嗜酸乳桿菌抑菌直徑達(dá)到23.53±0.06mm，與未經(jīng)定向培養(yǎng)抑菌直徑11.63±0.15mm的相比抑菌活性提高了約102％；經(jīng)定向培養(yǎng)的干酪乳桿菌抑菌直徑達(dá)到21.27±0.25mm，與未經(jīng)定向培養(yǎng)抑菌直徑12.50±0.10mm的相比抑菌活性提高了70.2％；⑦將抗菌肽添加到原奶中，在4℃和25℃下都能有效地抑制牛奶中細(xì)菌生長(zhǎng)及酸化。以上試驗(yàn)研究結(jié)果表明