抑制耐冷菌的乳酸菌抗菌肽篩選及其結構和抗菌機理研究.pdf

1、食品腐敗是指食品品質發(fā)生變化，而無法被人們所食用。引起食品腐敗的原因多種多樣，其中最主要的原因是由微生物引起的食品腐敗。微生物污染不僅可以出現(xiàn)在食品原料的初期，還可能伴隨著成品或半成品的加工和運輸過程中。人們通常選擇低溫保藏或者冷凍的方法，用于控制微生物的生長和繁殖，防止微生物引起的食品腐敗。但是耐冷菌的發(fā)現(xiàn)打破了人們對低溫或冷凍可以保證食品質量的認識。乳酸菌抗菌肽作為一種天然防腐劑，在抑制耐冷菌方面具有很大潛力。本研究以乳酸菌為研究對

2、象，旨在篩選出可以抑制假單胞菌的乳酸菌抗菌肽，并對抗菌肽的結構和抑菌機理及其理化性質進行研究，為抑制食品中耐冷菌的研究提供理論依據(jù)和基礎。
　　通過96-孔瓊脂擴散法，對實驗室保存的325株乳酸菌進行篩選。獲得兩株抑制菌耐冷菌的乳酸菌T1和Q7，通過對兩株發(fā)酵液中和有機酸實驗、過氧化氫排除實驗、蛋白酶驗證實驗以及Tricine-SDS-PAGE實驗，確定兩株菌發(fā)酵液中的抑菌物質為抗菌肽。通過對兩種抗菌肽性質研究，表明抗菌肽Ente

3、rocin T1和Plantaricin Q7可以有效抑制耐冷菌Pseudomonas flurescens AS1.1802，Pseudomonas putida AS1.1819，Pseudomonas aeruginosa CICC21636，Listeria monocytogenes ATCC19111和致病菌Escherichia coli ATCC25922，Salmonella typhimuriumATCC14028，

4、Shigella flexneri ATCC12022，Shigella sonnei ATCC25931，Staphylococcus aureus。在不同pH值和溫度下，抗菌肽Enterocin T1和Plantaricin Q7都具有穩(wěn)定的抑菌活性。蛋白酶E、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶以及木瓜蛋白酶都可以破壞兩種抗菌肽的活性。兩種抗菌肽對于不同的化學試劑都有很好的耐受性。通過16SrDNA和API種屬鑒定，確定產(chǎn)抗菌肽的二株菌種

5、屬：菌株T1為屎腸球菌（Enterococcus faecium）和菌株Q7植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum）。
　　以Enterococcus faecium T1和Lactobacillus plantarum Q7的發(fā)酵液為原料，依次采用SP-sepharose、CM-FF、Superdex Peptide10/300 GL對乳酸菌發(fā)酵液進行分離純化，最終獲得高純度的抗菌肽T1和抗菌肽Q7。LC-

6、ESI/MS測定抗菌肽Enterocin T1分子量為4629 Da、抗菌肽Plantaricin Q7的分子量為4624 Da。通過指紋圖譜分析兩種抗菌肽序列，并未發(fā)現(xiàn)與兩種抗菌肽含有相同的氨基酸序列。通過對兩種抗菌肽的氨基酸成份和序列的分析，抗菌肽Enterocin T1含有41個氨基酸，部分氨基酸序列為：M-A-E-T-F-A-P?？咕腜lantaricin Q7含有40個氨基酸，部分氨基酸序列為V-H-A-K-I-K-F-D。

7、
　　采用熒光探針標記法研究抗菌肽Enterocin T1和Plantaricin Q7對單增李斯特菌和熒光假單胞菌的抑菌機理，結果表明抗菌肽Enterocin T1和Plantaricin Q7都是通過吸附于單增李斯特菌細胞膜表面后，插入細胞膜的內部的作用方式抑制單增李斯特菌。抑制熒光假單胞菌的作用方式是以螯合Zn2+后，破壞熒光假單胞菌的外膜，最后作用細胞膜。研究還發(fā)現(xiàn)抗菌肽Enterocin T1破壞細胞胞上跨膜電位和pH梯

8、度，抗菌肽Plantaricin Q7只能破壞細胞上的pH梯度。兩種抗菌肽都能引起單增李斯特菌和熒光假單胞菌細胞內K+和磷酸鹽離子的泄露。
　　選取牛奶、豬肉、帶魚作為食品模型，研究抗菌肽Enterocin T1和Plantaricin Q7在食品防腐中的應用。并以感觀評價、菌落總數(shù)、TVB-N、pH值為主要指標反應抗菌肽Enterocin T1和Plantaricin Q7的保鮮效果。結果表明兩種抗菌肽可以有效的抑制熒光假單胞菌