貝類中2種食源性病毒標準樣品的研制.pdf

1、食源性病毒是由食物引起導致人類發(fā)生疾病的病毒，由于牡蠣等貝類產(chǎn)品的濾食性特點，對病毒有極強的富集作用。然而食源性病毒檢測目前多采用臨床腹瀉陽性樣本和滅活病毒疫苗，存在缺乏統(tǒng)一標準樣品的缺陷，這給病毒的檢測和定量帶來很多問題。本文基于裝甲RNA技術，利用Qbeta噬菌體分別研制諾如病毒和甲肝病毒核酸檢測用陽性標準樣品，對于提高檢測的可信性與準確性，保障我國食品安全，促進我國水產(chǎn)品國際貿易、規(guī)避國際貿易壁壘均有重要現(xiàn)實意義。
　　1通

2、過人工合成的方式分別制備包含Qbeta噬菌體成熟酶編碼基因、衣殼蛋白編碼基因、包裝位點、GⅡ型諾如病毒和甲肝病毒檢測靶標cDNA序列及輔助多克隆位點的QINVGⅡ和QGBHAV片段。然后通過重組酶分別將QINVGⅡ和QGBHAV片段同源克隆到pET-28a(+)載體中，經(jīng)過酶切和測序鑒定，成功構建重組質粒pET-QINVGⅡ和pET-QGBHAV。
　　2利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，分別將重組質粒pET-QINVGⅡ和pET-QGB

3、HAV轉入大腸桿菌BL21中，確定最佳表達為IPTG終濃度為0.8mM，37℃誘導12h。經(jīng)SDS-PAGE電泳驗證在14.4kDa左右有目的條帶;經(jīng)透射電鏡觀察病毒樣顆粒直徑為27nm，與預期結果一致。證實衣殼蛋白表達成功并能組裝成噬菌體病毒樣顆粒。
　　3通過超聲破碎細菌，經(jīng)DNaseⅠ和Rnase A消化后利用CsC1密度梯度離心和純化。制備的兩種假病毒粒子無重組質粒殘留，可以用于熒光定量檢測。
　　4利用熒光定量PC

4、R技術成功證實兩種病毒樣顆粒中包裝的核酸分別是諾如病毒RNA和甲肝病毒RNA。將病毒RNA梯度稀釋后，經(jīng)RT-qPCR驗證線性關系良好，方法檢出限為10拷貝/反應，有很好的重復性，可以用于病毒檢測用標準樣品。定值結果顯示制備的含GⅡ型諾如病毒的病毒樣顆粒含量為2×109拷貝/μL，瓶間變異系數(shù)為3.48％;含甲肝病毒的病毒樣顆粒含量為3×109拷貝/μL，瓶間變異系數(shù)為4.26％。
　　5將制備好的兩種病毒樣顆粒分別稀釋至2×10

5、7拷貝/μL和106拷貝/μL，放置于不同條件下進行穩(wěn)定性實驗。研究結果表明:非凍干狀態(tài)的樣本在37℃能保存半個月，室溫可穩(wěn)定保存25天，2-8℃可穩(wěn)定放置5個月，-20℃穩(wěn)定放置至少5個月;凍干狀態(tài)的樣本在37℃和25℃下不穩(wěn)定，在4℃和-20℃能穩(wěn)定放置5個月。
　　本研究得到了分別含有GⅡ型諾如病毒和甲肝病毒檢測核酸序列的兩種病毒樣顆粒標準樣品，可以作為目前臨床腹瀉陽性樣本和滅活病毒疫苗制備的質控品的替代品，適用于疾控、質檢